Summary

마이 그 레이션의 인간 T 림프구 분리, 문화 및 분석 체외에서</em

Published: June 01, 2010
doi:

Summary

T 림프구 마이 그 레이션 림프 기관, vasculature에서 출구로 유도하는 동안 발생하고, 주변 조직을 체결. 여기, 우리는 T 림프구 마이 그 레이션을 분석하는 데 사용할 수있는 프로토콜을 설명<em> 체외에서</em>.

Abstract

T lymphocytes의 마이 그 레이션은 다른 세포 또는 세포외 기질 단백질로 표현 리간드와 함께 세포 표면 integrins의 접착제 상호 작용을 포함한다. 낮은 친화 상태에서 세포 첨단에 높은 친화력 상태로 integrins의 정확한 spatiotemporal 활성화 T 림프구 마이 그 레이션에 대한 중요<sup> 1</sup>. 마찬가지로, 세포 후행 가장자리의 철회는, 또는 uropod, 영구적인 인테 종속적인 T 림프구의의 운동성을 유지하는 데 필요한 단계입니다<sup> 2</sup>. 수단으로 면역 또는 염증 질환 대상 integrins 많은 치료 방법은 leukocytes의 과도한 모집 및 마이 그 레이션을 억제하기 위해<sup> 3</sup>. 인간의 T 림프구의 마이 그 레이션을 조절 분자 이벤트를 연구하기 위해, 우리는를 활용해야<em> 체외에서</emT 림프구는 vasculature에서 모집하는 동안 발생하는 환경을 모방 2 차원 기판의 셀 마이 그 레이션을 분석> 시스템. T의 lymphocytes 먼저 인간의 기증자로부터 격리되고 나서 자극을 7 일에서 열흘 동안 양식입니다. 분석하는 동안, T의 lymphocytes는 세포 유착 분자 -1 (ICAM – 1), 인테 LFA – 1에 대한 리간드와 stromal 세포 – 파생 요소 – 1 (SDF – 1) 코팅 기판에 준수 및 마이 그 레이션하는 허용됩니다. 우리의 데이터는 T lymphocytes는 ~ 15 μm의 / 분 철새 속도를 전시 것을 보여줍니다. T 림프구 마이 그 레이션은 인테 그린의 봉쇄에 의해 저해 수 있습니다<sup> 1</sup> 또는 세포 actomyosin 기계 억제제에 의해 그 세포 마이 그 레이션을 조절<sup> 2</sup>.

Protocol

1. 인간의 T Lymphocytes의 분리 건강한 기증자로부터 인간의 혈액을 구합니다. 혈액은 다음 단계로 진행하기 전에 실내 온도 (~ 30 분)로 냉각 수 있습니다. 부드럽게 8 ML 왕복 하단의 폴리스티렌 튜브로 실내 온도 Polymorph 밀도 기울기 미디어 3 ML을 피펫. 부드럽게 Polymorph 미디어 위에 전체 혈액의 3 ML를 추가합니다. 두 시약의 혼합되지 않도록하는 것이 중요합니다. 실온에서 45 ?…

Discussion

본 실험에서는, 우리는 기본 인간 T의 lymphocytes의 운동성를 분석하는 간단한 시스템에 대한 자세한 내용을 제공합니다. 체외 마이 그 레이션 assays 다양한 세포 유형의 운동에 관련된 다양한 분자와 신호 경로의 역할을 해부하다하는 데 사용되었습니다. 우리 프로토콜에서 자신의 실험을 설계할 때 염두에 두어야하는 몇 가지 중요한 컨트롤은 다음과 같습니다 : 1) 소 혈청 알부민 (BSA)…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 프로젝트는 국민 건강 기금 HL087088 (MK)의 연구소와 HL18208 (MK)에 의해 지원되었다.

Materials

Material Name Tipo Company Catalogue Number Comment
RPMI 1640   Gibco 11875  
FBS   Thermo Scientific SH300070.03  
Penicillin-Streptomycin   Gibco 15140  
1-Step Polymorphs   Accurate Chemical AN221725  
PHA   Remel/Fisher Scientific R30852801  
Rec. human IL-2   R&D Systems 202-IL  
Rec. human IL-15   R&D Systems 247-IL  
Protein G   Sigma Aldrich 19459  
Rec. human ICAM-1/Fc   R&D Systems 720-IC  
Rec. human SDF-1   R&D Systems 350-NS  

Referencias

  1. Hyun, Y. M., Chung, H. L., McGrath, J. L., Waugh, R. E., Kim, M. Activated integrin VLA-4 localizes to the lamellipodia and mediates t cell migration on VCAM-1. J Immunol. 183, 359-369 (2009).
  2. Morin, N. A., Oakes, P. W., Hyun, Y. M., Lee, D., Chin, Y. E., King, M. R., Springer, T. A., Shimaoka, M., Tang, J. X., Reichner, J. S., Kim, M. Nonmuscle myosin heavy chain IIA mediates integrin LFA-1 de-adhesion during T lymphocyte migration. The Journal of experimental medicine. 205, 195-205 (2008).
  3. Hyun, Y. M., Lefort, C. T., Kim, M. Leukocyte integrins and their ligand interactions. Immunologic research. , (2009).

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Citar este artículo
Lefort, C. T., Kim, M. Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro. J. Vis. Exp. (40), e2017, doi:10.3791/2017 (2010).

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