Summary

האדם בידוד T לימפוציטים, התרבות ניתוח של הגירה במבחנה</em

Published: June 01, 2010
doi:

Summary

T לימפוציטים הגירה מתרחשת במהלך הביות הלימפה לאיברים, יציאה vasculature, וכניסה לתוך רקמות הפריפריה. כאן אנו מתארים פרוטוקול כי ניתן להשתמש כדי לנתח את ההגירה T לימפוציטים<em> במבחנה</em>.

Abstract

ההגירה של לימפוציטים מסוג T מערבת את האינטראקציה של דבק integrins פני התא עם ligands הביע על תאים אחרים או עם חלבונים תאי מטריקס. הפעלת spatiotemporal המדויק של integrins ממצב נמוך זיקה למדינה זיקה גבוהה בקצה התא מוביל חשוב T לימפוציטים הגירה<sup> 1</sup>. כמו כן, הכחשה של קצה תא נגרר, או uropod, הוא צעד הכרחי בשמירה על תנועתיות מתמשך integrin תלויי T לימפוציטים<sup> 2</sup>. גישות טיפוליות רבות integrins מחלות אוטואימוניות דלקתיות או יעד כאמצעי לעכב את גיוס הגירה מופרזת של לויקוציטים<sup> 3</sup>. כדי לחקור את האירועים המולקולריים המווסתים את נדידת האדם T לימפוציטים, יש לנו מנוצל<em> במבחנה</em> מערכת לנתח נדידת תאים על מצע דו מימדי המחקה את הסביבה כי לימפוציטים T מפגשים במהלך גיוס של כלי הדם. לימפוציטים מסוג T הם בודד לראשונה מתורמים האדם הם מגורה אז בתרבית במשך שבעה עד עשרה ימים. במהלך assay, לימפוציטים מסוג T מותר לדבוק ולהעביר על מצע מצופה מולקולה-1 הידבקות אינטר (ICAM-1), ליגנד עבור integrin LFA-1, הגורם-1 סטרומה תא הנגזרות (SDF-1). הנתונים שלנו מראים כי לימפוציטים מסוג T התערוכה מהירות הנדידה של ~ 15 מיקרומטר / min. T לימפוציטים הגירה יכולה להיות מעוכבים על ידי המצור integrin<sup> 1</sup> או מעכבי של המנגנון המווסת actomyosin הסלולר נדידת תאים<sup> 2</sup>.

Protocol

1. בידוד של האדם לימפוציטים-T השג דם אדם מתורם בריא. לאפשר לדם להתקרר לטמפרטורת החדר (~ 30 דקות) לפני שתמשיך לשלב הבא. בעדינות פיפטה 3 מ"ל של בטמפרטורת החדר צפיפות התקשורת Polymorph הדרגתי לתוך צינ?…

Discussion

בניסוי זה, אנו מספקים פרטים על מערכת פשוטה לנתח את תנועתיות העיקרי של לימפוציטים מסוג T אנושיים. ב מבחני חוץ גופית הגירה שימשו לנתח את התפקידים של מולקולות רבות במעברי האותות המעורבים תנועה של תאים מסוגים שונים. חלק שולטת קריטי לזכור בעת תכנון הניסוי שלכם מת…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

פרויקט זה מומן על ידי המכונים הלאומיים לבריאות מענקים HL087088 (ח"כ) ו HL18208 (ח"כ).

Materials

Material Name Tipo Company Catalogue Number Comment
RPMI 1640   Gibco 11875  
FBS   Thermo Scientific SH300070.03  
Penicillin-Streptomycin   Gibco 15140  
1-Step Polymorphs   Accurate Chemical AN221725  
PHA   Remel/Fisher Scientific R30852801  
Rec. human IL-2   R&D Systems 202-IL  
Rec. human IL-15   R&D Systems 247-IL  
Protein G   Sigma Aldrich 19459  
Rec. human ICAM-1/Fc   R&D Systems 720-IC  
Rec. human SDF-1   R&D Systems 350-NS  

Referencias

  1. Hyun, Y. M., Chung, H. L., McGrath, J. L., Waugh, R. E., Kim, M. Activated integrin VLA-4 localizes to the lamellipodia and mediates t cell migration on VCAM-1. J Immunol. 183, 359-369 (2009).
  2. Morin, N. A., Oakes, P. W., Hyun, Y. M., Lee, D., Chin, Y. E., King, M. R., Springer, T. A., Shimaoka, M., Tang, J. X., Reichner, J. S., Kim, M. Nonmuscle myosin heavy chain IIA mediates integrin LFA-1 de-adhesion during T lymphocyte migration. The Journal of experimental medicine. 205, 195-205 (2008).
  3. Hyun, Y. M., Lefort, C. T., Kim, M. Leukocyte integrins and their ligand interactions. Immunologic research. , (2009).

Play Video

Citar este artículo
Lefort, C. T., Kim, M. Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro. J. Vis. Exp. (40), e2017, doi:10.3791/2017 (2010).

View Video