In diesem Video zeigen wir effiziente Elektrofusion von Zellen<em> In-vitro-</em> Durch modifizierte Einhaltung Methode mittels Elektroporation und der anschließenden Detektion der fusionierten Zellen Visualisierung mit Fluoreszenzmikroskopie.
Zell Elektrofusion ist eine sichere, nicht-virale und nicht-chemischen Methode, die für die Vorbereitung Hybridzellen für die menschliche Therapie eingesetzt werden können. Elektrofusion umfasst die Anwendung von kurzen Hochspannungs-elektrische Impulse auf Zellen, die in engem Kontakt sind. Anwendung von kurz-, Hochspannungs-elektrische Impulse bewirkt eine Destabilisierung der Zell-Plasmamembranen. Destabilisierte Membranen sind durchlässig für verschiedene Moleküle und auch anfällig für Fusion mit einer benachbarten destabilisiert Membranen. Elektrofusion ist somit eine bequeme Methode, um eine unspezifische Verschmelzung von sehr verschiedenen Zellen zu erreichen<em> In-vitro-</em>. Um fusion, Zellmembranen, durch elektrisches Feld destabilisiert zu erhalten, muss in einem engen Kontakt sein, damit Zusammenlegung ihrer Lipid-Doppelschichten und damit ihrem Zytoplasma. In diesem Video zeigen wir, effiziente Elektrofusion von Zellen<em> In-vitro-</em> Durch modifizierte Einhaltung Methode. Bei dieser Methode, Zellen dürfen nur leicht anzubringen, um die Oberfläche des gut, so dass mittelfristig ausgetauscht werden können und Zellen noch behalten ihre Kugelform. Fusion Visualisierung wird durch pre-Kennzeichnung von dem Zytoplasma von Zellen mit unterschiedlichen fluoreszierenden Zellen tracker Farbstoffe untersucht, die Hälfte der Zellen sind mit orangen CMRA und die andere Hälfte mit grünen CMFDA gekennzeichnet. Fusion Ausbeute ist definiert als die Anzahl der dual fluoreszierenden Zellen mit der Anzahl aller Zellen durch zwei dividiert bestimmt.
Die Fähigkeit der Zellmembranen zu unspezifisch, zB durch äußere elektrische Felder, Sicherung ist für die Biotechnologie, Medizin und Forschung in der Biologie wichtig. Solche unspezifischen Fusion ermöglicht die Produktion von hochwertigen Hybrid-Zellen und ihre Produkte, wie monoklonale Antikörper, und liefert Informationen über grundlegende Mechanismen der Fusion [2]. Elektrofusion ist eine potenziell sehr wirksame Methode, da kann es richtig, um verschiedene Arten von Zellen eingestellt werden. Elektrofusion wird erreicht, wenn Zellen in engen körperlichen Kontakt in ihre fusogene Zustand gebracht werden (Gefahr der Fusion) mit Hilfe von Hochspannungs-elektrischen Impulsen. Die Effizienz der Elektrofusion hängt von verschiedenen Parametern, die beiden Teile der Elektrofusion Prozess beeinflussen. Erster Teil des Heizwendel-ist das Erreichen des engen körperlichen Kontakt zwischen den Zellen, die mit verschiedenen Methoden erhalten werden [3-8]. Die Einhaltung Methode (wachsenden Zellen bis zur Konfluenz) können effizient durch spontan entstandene Zellkontakte in großen Zonen zwischen Zellen verwendet werden, jedoch bringt es sehr große fusionierten Zellen mit vielen Kernen. Wir sind mit der modifizierten Einhaltung Methode, wo kleinere Zellen (mit 2 bis 5 Kerne), die eher zu überleben und sich vermehren, gewonnen werden (Abbildung 1). Kontakt zwischen den Zellen auch aus osmotischen Schwellung der Zellen profitieren durch osmotische Behandlung im Experiment [9] verwendet. Zweiter Teil der Elektrofusion Prozess ist das Erreichen der fusogene Zustand der Zellmembranen. Fusogene Zustand korreliert gut mit electropermeabilized Zustand der Membran (Zellen sind unspezifisch permeabilisiert, um Moleküle, die normalerweise nicht durch die intakte Membran passieren können) und wird von den gleichen Parametern der elektrischen Impulse (Amplitude, Länge, Anzahl und Häufigkeit) geregelt [10] . Die Werte der elektrischen Parameter für die optimale Elektroporation benötigt [1] und Elektrofusion zwischen verschiedenen Zellen unterschiedlich und hängen von Zellen Größe und ihrer biologischen Eigenschaften. Elektrische Parameter müssen daher für verschiedene Zelllinien, die als Fusionspartner verwendet werden, die Fusion zu erhalten optimiert werden.
The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit wurde von der slowenischen Research Agency (Projekt J2-9764 und das Programm P2-0249) unterstützt. Dieses Video stellt ergänzendes Material für die "Elektroporation basierenden Technologien und Behandlungsmethoden" wissenschaftlichen Workshop und Aufbaustudium, von der Fakultät für Elektrotechnik an der University of Ljubljana, Slowenien organisiert.
Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
CMRA | Reagent | Invitrogen | C34551 | Cytosolic fluorescent dye |
CMFDA | Reagent | Invitrogen | C7025 | Cytosolic fluorescent dye |
DMSO | Reagent | Sigma-Aldrich | D2650 | |
DMEM | Reagent | Sigma-Aldrich | D5671 | Dulbecco’s modified Eagle’s medium |
Fetal calf serum | Reagent | Sigma-Aldrich | F4135 | |
L-glutamine | Reagent | Sigma-Aldrich | G7513 | |
crystacillin | Reagent | Pliva | 625110 | antibiotic |
gentamicin | Reagent | Sigma-Aldrich | G1397 | antibiotic |
Hepes | Reagent | Sigma-Aldrich | H0887 | |
KH2PO4 | Reagent | Merck | A124873 927 | |
KH2PO4 | Reagent | Sigma-Aldrich | 4248 | |
MgCl2 | Reagent | Sigma-Aldrich | M-8266 | |
NaCl | Reagent | Fluka | 71382 | |
KCl | Reagent | Merck | A154336 908 | |
MgSO4 | Reagent | Sigma-Aldrich | M2643 | |
D-glucose | Reagent | Sigma-Aldrich | G8270 | |
CaCl2 | Reagent | Sigma-Aldrich | C4901 | |
sucrose | Reagent | Sigma-Aldrich | 16104 | |
Electric pulse generator | Tool | Igea | Cliniporator VITAE | |
Multiwell plate | Tool | TPP | 92424 | |
50 ml centrifuge tube | Tool | TPP | 91050 | |
15 ml centrifuge tube | Tool | TPP | 91015 | |
25 cm2 culture flask | Tool | TPP | 90026 | |
Electrodes | Tool | Custom made | Pt/Ir |