متصور الكهربائي زنزانة مع مضان المجهري

أولا تحميل الخلايا مع الخلايا بتتبع CMFDA وCMRA وقد أجريت تجارب على خلايا سرطان الجلد معدة مسبقا من الماوس خط الخلية (B16 – F1). تزرع الخلايا في اثنين من فصل القوارير 25 سم ثقافة 2 (TPP ، ZDA) لالتقاء 70-80 ٪ في المتوسط ​​الثقافة DMEM (وسط Dulbecco لتعديل النسر) تستكمل مع مصل بقري جنيني من 10 ٪ ، 0.15 ملغ / مل L – الجلوتامين ، 16 ملغ / مل جنتاميسين (جميع من سيغما الدريخ ، ألمانيا) ، 200 وحدة / مل crystacillin (شركة بليفا ، كرواتيا) ، وحضنت في 5 ٪ CO 2 عند 37 درجة مئوية. إعداد two الأسهم 10 ملم حلول تعقب الخلية (Invitrogen ، الولايات المتحدة الأمريكية) وذلك بإضافة 10.76 ميكرولتر و 9 ميكرولتر (على الأخضر والبرتقالي CMFDA CMRA ، على التوالي) من DMSO (سيغما الدريخ ، ألمانيا) إلى 50 ميكروغرام من الصبغة في النص الأصلي Invitrogen القارورة. ويمكن تخزين محلول المخزون في ثلاجة عند 4 درجة مئوية لمدة بضعة أشهر. قبل البدء في التجارب ، والاحماء الحل حتى تذوب بلورات DMSO. تعد خالية من بيكربونات كريبس – Hepes العازلة (130 مم كلوريد الصوديوم و 4.7 ملي بوكل ، 1.2 ملي MgSO 4 ، 1.2 ملم KH 2 PO 4 ، 11.7 ملي D – غلوكوز ، 1.3 ملي CaCl 2 ، 10 HEPES ملي ، ودرجة الحموضة 7.4). في اثنين من 15 مل إيبندورف أنابيب منفصل مزيج 2.1 ميكرولتر من كل حل سهم (10 ملم أو CMFDA CMRA ، على التوالي) في 3 مل من العازلة كريبس – Hepes بيكربونات خالية. هذه الغلة "حل تحميل" التي تحتوي على ما يقرب من 7 CMFDA ميكرومتر (أو CMRA). شطف الخلايا مرتين مع العازلة كريبس – Hepes بيكربونات خالية من ثم إدراج وتحميل حلول في قوارير. احتضان الخلايا لمدة 30 دقيقة في 5 ٪ CO 2 عند 37 درجة مئوية. خلال هذه الكواشف حضانة first يمر بحرية من خلال أغشية الخلايا ، ولكن مرة واحدة داخل الخلية ، وتحولت إلى خلية الكواشف impermeant منتجات التفاعل الفلورسنت. بعد مرور فترة الحضانة الأولى ، واحتضان شطف الخلايا مع مستنبت لمدة ساعتين في 5 ٪ CO 2 عند 37 درجة مئوية. يعرض للتريبسين الخلايا في كل من قوارير (محملة CMFDA وCMRA) ومزيج خلايا الدم الحمراء والخضراء معا في نسبة 1:1 في أنبوب الطرد المركزي 50 مل (TPP ، ZDA). ضبط تركيز الخلية إلى الخلايا 5 × 6 / 10 مل من قبل مع تخفيف DMEM المتوسطة أو مع تركيز أجهزة الطرد المركزي. مكان انخفاضا بنسبة 20 ميكرولتر من تعليق خلية في كل بئر من لوحة multiwell 24 (TPP ، ZDA). احتضان خلايا في 5 ٪ CO 2 عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة للسماح لهم نعلق قليلا على سطح البئر وإقامة اتصالات الخلية. II. الكهربائي إعداد isoosomolar العازلة فوسفات البوتاسيوم (10 ملم KH2PO4 ، 10 ك 2 ملي هبو 4 ، 1MM MgCl 2 ، 250 ملي السكروز) وhypoosmolar العازلة فوسفات البوتاسيوم (10 ملم KH2PO4 ، 10 ك 2 ملي هبو 4 ، 1MM MgCl 2 ، 75 ملي السكروز) . ضع multiwell مع الخلايا على موقف المجهر ، مرحلة الأقطاب في قاع البئر وربطها مولد النبض. غسل الخلايا مع 1 مل من isoosomolar العازلة الفوسفات البوتاسيوم. إضافة 350 ميكرولتر من hypoosmolar العازلة الفوسفات البوتاسيوم من أجل حمل تورم الخلية. ينبغي أن تغطي العازلة الأقطاب. ترك الخلايا في hypoosmolar العازلة لمدة 2 دقيقة قبل تطبيق نبضات كهربائية. خلال هذا الوقت من تدفق جزيئات الماء في الخلايا نتيجة لاختلال التوازن التناضحي بين الداخل والخارج من الخلايا يسبب زيادة حجم الخلية. ينبغي أن تطبق النبضات الكهربائية عند الخلايا هي قريبة من أحجامها القصوى ، وذلك قبل بدء انخفاض حجم التنظيمية. لتحقيق الكهربائي الأمثل والحفاظ على سلامة الخلية ، يجب استخدام المعلمات الأمثل للنبضات الكهربائية. هذه تعتمد على خط الخلية المستخدمة [1]. في هذه التجربة يتم تطبيقها قطار من 8 البقول مستطيلة (مع كل مدة من 100 ميكرو ثانية في 1 هرتز) لكل عينة ، وذلك باستخدام جهاز electroporation (Cliniporator في حالتنا ، IGEA ، إيطاليا). يتم تسليم لنبضات كهربائية متوازيين سلك حزب العمال / عير بقطر 0.8 ملم و 5 ملم المسافة بينهما ، وتهيئة المجال الكهربائي لحوالي 1200 V / سم بين الأقطاب في كل بئر ، باستثناء عنصر التحكم بشكل جيد. ترك الخلايا دون عائق لمدة 10 دقيقة بعد الولادة النبض. تحديد العائد الانصهار عن طريق الفحص المجهري النقيض الفلورسنت والمرحلة. III. الحصول على الصور وتحديد العائد الانصهار ويلاحظ في الخلايا باستخدام المجهر مضان (في حالة لدينا زايس AxioVert 200 ، زايس ، ألمانيا) مجهزة هدفا (X20) وكاميرا CCD تبريد (VisiCam 1280 ، Visitron ، ألمانيا). يتم الحصول على الصور في MetaMorph 7.1.1 (الأجهزة الجزيئية ، الولايات المتحدة الأمريكية) ، ولكن يمكن أيضا استخدام برامج أخرى مشابهة يمكن اكتساب. هو متحمس CMFDA مع مستوحد اللون (فازة الرابع ، Visitron والمانيا) في 492 نانومتر و 548 نانومتر في CMRA. ويتم الحصول على ومضان من CMFDA CMRA باستخدام مرشحات الانبعاثات ، أحدهما يركز على نانومتر 535 (HQ535/30m ، لCMFDA) وتركز الأخرى على 510 نانومتر (D605/55m ، لCMRA ، سواء كروما ، الولايات المتحدة). منعت استخدام مزدوج اللون المرآة (Q515LP) الحديث عبر القناة. الحصول على ثلاث صور (المرحلة النقيض والأحمر والأخضر ومضان) لمدة خمسة حقول اختيارها عشوائيا في كل بئر. إنشاء صور ثلاثة من كل قناة الثلاثي الصورة. ويمكن في مثل هذه الصورة أن ينظر إلى السيتوبلازم الاستشعاع مع أغشية الخلايا. وبالتالي يمكن أن تنصهر فيها خلايا تحدد بسهولة [الشكل 1]. عد كافة الأنواع الثلاثة من الخلايا (الأحمر والأخضر والفلورسنت مزدوج) في كل صورة القناة الثلاث. تحديد نسبة الخلايا الفلورسنت مزدوج بقسمة عدد الخلايا الفلورسنت بشكل مزدوج مع عدد من كافة الخلايا في كل صورة. يتم تعريف العائد الانصهار كنسبة مئوية من الخلايا الفلورسنت مزدوج مضروبا منذ 2 لم يتم الكشف عن نصف الخلايا تنصهر (عندما خلايا فتيل نفس اللون). ممثل النتائج الشكل 1 ثلاثة صورة مجهرية قناة B16F1 الخلايا بعد الكهربائي : المرحلة المقابل ، CMRA مضان (الإثارة في 548 نانومتر) وCMFDA مضان (الإثارة في 492 نانومتر) ، التكبير الهدف 20X