Etiquetado y las Pilas de imágenes en la parte posterior del cerebro de pez cebra
Summary
La clave para entender los procesos morfogenéticos que forma el embrión temprano es la capacidad de las células de la imagen en alta resolución. Se describe aquí una técnica para el etiquetado de las células individuales o pequeños grupos de células en embriones de pez cebra con toda la membrana dirigidos proteína verde fluorescente.
Abstract
La clave para entender los procesos morfogenéticos que forma el embrión de vertebrados temprana es la capacidad de las células de la imagen en alta resolución. En embriones de pez cebra, la inyección de los resultados de ADN plásmido en la expresión del mosaico, lo que permite la visualización de células individuales o pequeños grupos de células<sup> 1</sup>. Se describe cómo la inyección de ADN que codifica plásmido membrana dirigidos proteína verde fluorescente (mGFP) bajo el control de un promotor en todas partes se puede utilizar para que las células sometidas a imágenes neurulación. Central de este protocolo es la metodología de las células de imágenes etiquetadas en alta resolución en las secciones y también en tiempo real. Este protocolo implica la inyección de ADN en embriones de pez cebra mGFP jóvenes. Los embriones son luego procesadas para seccionar vibratome, el etiquetado de anticuerpos y la imagen con un microscopio confocal. Por otra parte, los embriones vivos que expresan mGFP se pueden crear imágenes con lapso de tiempo de microscopía confocal. Hemos utilizado anteriormente este método sencillo para analizar los comportamientos celulares que conducen a la formación del tubo neural en la región posterior del cerebro de embriones de pez cebra<sup> 2</sup>. Los preparativos fijo permitido para la visualización sin precedentes de formas de organización celular y en el tubo neural, mientras que imágenes en vivo complementa este enfoque permite una mejor comprensión de la dinámica celular que tienen lugar durante la neurulación.
Protocol
Discussion
En conclusión, las técnicas de etiquetado descritos aquí permiten el análisis de células individuales de los procesos morfogenéticos en el embrión de pez cebra. El énfasis principal de este protocolo es sobre los métodos para que las células de imágenes etiquetadas en el tubo neural con mGFP bajo el control de un promotor en todas partes. Para otras aplicaciones de este ensayo de expresión transitoria lectores deben referirse a un documento reciente de Andersen et al. 3.
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por una subvención del NIH otorgado a R. Brewster (1R01GM085290-01A1).
Materials
Solutions
- Hank’s Stock #1: 8.0 g NaCl , 0.4 g KCl in 100 ml dd H2O
- Hank’s Stock #2: 0.358 g Na2HPO4 Anhydrous, 0.60 g KH2PO4 in 100 ml ddH2O
- Hank’s Stock #4: 0.72 g CaCl2 in 50 ml ddH2O
- Hank’s Stock #5: 1.23 g MgSO4x7H2O in 50 ml dd H2O
- 1 X Phosphate Buffer: 0.8% NaCl, 0.02% KCl, 0.02 M PO4, pH 7.3
- Blocking Solution: 2% normal goat serum, 1% bovine serum albumin (BSA), 1% dimethysulfoxide (DMSO)
Referencias
- Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. . Zebrafish Practical approach series. , (2002).
- Hong, E., Brewster, R. N-cadherin is required for the polarized cell behaviors that drive neurulation in the zebrafish. Development. 133, 3895-3905 (2006).
- Andersen, E., Asuri, N., Clay, M., Halloran, M. Live Imaging of Cell Motility and Actin Cytoskeleton of Individual Neurons and Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos. J Vis Exp. , (2010).
