סימון תאים הדמיה למוח האחורי של דג הזברה
Summary
מפתח להבנת תהליכים המוךפו"גנטי שהולך המעצבים את העובר המוקדם הוא היכולת תאים תמונה ברזולוציה גבוהה. אנו מתארים כאן טכניקה תיוג תאים בודדים או קבוצות קטנות של תאים עוברי דג הזברה שלם עם חלבון הממברנה ממוקד, פלורסנט ירוק.
Abstract
מפתח להבנת תהליכים המוךפו"גנטי שהולך המעצבות את העובר החולייתנים הראשונים הוא היכולת תאים תמונה ברזולוציה גבוהה. בשנת עוברי דג הזברה, הזרקה של תוצאות ה-DNA פלסמיד בביטוי פסיפס, המאפשר ויזואליזציה של תאים בודדים או קבוצות קטנות של תאים<sup> 1</sup>. אנו מתארים כיצד הזרקה של קידוד הדנ"א פלסמיד קרום במיקוד חלבון פלואורסצנטי ירוק (mGFP) בשליטת היזם בכל מקום ניתן להשתמש בתאים הדמיה עוברת neurulation. במרכז פרוטוקול זה הוא מתודולוגיה תאים הדמיה ברזולוציה גבוהה שכותרתו בסעיפים וגם בזמן אמת. פרוטוקול זה מחייב את הזריקה של ה-DNA mGFP לעוברי דג הזברה הצעיר. עוברים מעובדים ואז חתך vibratome, תיוג נוגדן הדמיה במיקרוסקופ confocal. לחלופין, עוברים לגור להביע mGFP ניתן הדמיה באמצעות זמן לשגות מיקרוסקופיה confocal. השתמשנו בעבר הגישה הזאת פשוט לנתח את התנהגות הסלולר כי הכונן היווצרות בצינור העצבי באזור למוח האחורי של עוברי דג הזברה<sup> 2</sup>. ההכנות קבוע מותר להדמיה חסר תקדים של צורות התא הארגון הצינור העצבי בעוד הדמיה לחיות השלים גישה זו המאפשרת הבנה טובה יותר של הדינמיקה הסלולר המתרחשים במהלך neurulation.
Protocol
Discussion
לסיכום, שיטות תיוג המתוארת כאן לאפשר לניתוח תא בודד של תהליכים המוךפו"גנטי שהולך בעובר דג הזברה. הדגש העיקרי של פרוטוקול זה הוא על שיטות דימות תאים שכותרתו בצינור העצבי באמצעות mGFP בשליטת היזם בכל מקום. עבור יישומים נוספים של הקוראים זה assay חולף ביטוי לעיין במאמר לא?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענק NIH הוענק ר ברוסטר (1R01GM085290-01A1).
Materials
Solutions
- Hank’s Stock #1: 8.0 g NaCl , 0.4 g KCl in 100 ml dd H2O
- Hank’s Stock #2: 0.358 g Na2HPO4 Anhydrous, 0.60 g KH2PO4 in 100 ml ddH2O
- Hank’s Stock #4: 0.72 g CaCl2 in 50 ml ddH2O
- Hank’s Stock #5: 1.23 g MgSO4x7H2O in 50 ml dd H2O
- 1 X Phosphate Buffer: 0.8% NaCl, 0.02% KCl, 0.02 M PO4, pH 7.3
- Blocking Solution: 2% normal goat serum, 1% bovine serum albumin (BSA), 1% dimethysulfoxide (DMSO)
Referencias
- Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. . Zebrafish Practical approach series. , (2002).
- Hong, E., Brewster, R. N-cadherin is required for the polarized cell behaviors that drive neurulation in the zebrafish. Development. 133, 3895-3905 (2006).
- Andersen, E., Asuri, N., Clay, M., Halloran, M. Live Imaging of Cell Motility and Actin Cytoskeleton of Individual Neurons and Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos. J Vis Exp. , (2010).
