L'étiquetage et l'imagerie des cellules dans le cerveau postérieur Zebrafish
Summary
La clé de la compréhension des processus morphogénétiques qui façonnent l'embryon précoce est la capacité de cellules d'image à haute résolution. Nous décrivons ici une technique de marquage des cellules individuelles ou de petits amas de cellules dans des embryons de zebrafish entier avec membrane cible protéine fluorescente verte.
Abstract
La clé de la compréhension des processus morphogénétiques qui façonnent l'embryon vertébré précoce est la capacité de cellules d'image à haute résolution. Dans les embryons de poisson zèbre, l'injection des résultats d'ADN plasmidique dans l'expression de la mosaïque, permettant la visualisation de cellules individuelles ou de petits amas de cellules<sup> 1</sup>. Nous décrivons comment l'injection de l'encodage d'ADN plasmidique membrane cible Green Fluorescent Protein (mGFP) sous le contrôle d'un promoteur ubiquitaire peut être utilisé pour les cellules de l'imagerie subissant la neurulation. Au centre de ce protocole est la méthodologie utilisée pour l'imagerie des cellules marquées à haute résolution dans les sections et aussi en temps réel. Ce protocole implique l'injection d'ADN dans des embryons de poisson zèbre mGFP jeunes. Les embryons sont ensuite traitées pour sectionner vibratome, l'étiquetage d'anticorps et d'imagerie avec un microscope confocal. Alternativement, les embryons vivants exprimer mGFP peuvent être imagées par time-lapse microscopie confocale. Nous avons déjà utilisé cette approche simple pour analyser les comportements cellulaires qui déterminent la formation du tube neural dans la région du cerveau postérieur de l'embryon de poisson zèbre<sup> 2</sup>. Les préparatifs fixes a permis pour la visualisation sans précédent des formes de cellules et de l'organisation dans le tube neural, tandis que l'imagerie vivre complété cette approche permettant une meilleure compréhension de la dynamique cellulaire qui se déroulent pendant la neurulation.
Protocol
Discussion
En conclusion, les techniques de marquage décrites ici permettent une analyse simple cellule de processus morphogénétiques dans l'embryon de poisson zèbre. L'accent principal de ce protocole est sur les méthodes d'imagerie des cellules étiquetées dans le tube neural en utilisant mGFP sous le contrôle d'un promoteur ubiquitaire. Pour des applications supplémentaires de ce test d'expression transitoire de lecteurs devraient se référer à un document récent de Andersen et al. 3…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par une subvention du NIH décerné à R. Brewster (1R01GM085290-01A1).
Materials
Solutions
- Hank’s Stock #1: 8.0 g NaCl , 0.4 g KCl in 100 ml dd H2O
- Hank’s Stock #2: 0.358 g Na2HPO4 Anhydrous, 0.60 g KH2PO4 in 100 ml ddH2O
- Hank’s Stock #4: 0.72 g CaCl2 in 50 ml ddH2O
- Hank’s Stock #5: 1.23 g MgSO4x7H2O in 50 ml dd H2O
- 1 X Phosphate Buffer: 0.8% NaCl, 0.02% KCl, 0.02 M PO4, pH 7.3
- Blocking Solution: 2% normal goat serum, 1% bovine serum albumin (BSA), 1% dimethysulfoxide (DMSO)
Referencias
- Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. . Zebrafish Practical approach series. , (2002).
- Hong, E., Brewster, R. N-cadherin is required for the polarized cell behaviors that drive neurulation in the zebrafish. Development. 133, 3895-3905 (2006).
- Andersen, E., Asuri, N., Clay, M., Halloran, M. Live Imaging of Cell Motility and Actin Cytoskeleton of Individual Neurons and Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos. J Vis Exp. , (2010).
