Summary

Akute Einzel-Multi-Elektroden-Ableitungen aus dem Hirnstamm von Mäusen mit fixiertem Kopf

Published: October 11, 2024
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Summary

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode, um in vivo Einzelneuronen-Aufzeichnungen mit hoher Dichte aus dem Hirnstamm von kopffixierten Mäusen zu erhalten. Dieser Ansatz wird eingesetzt, um das Aktionspotentialfeuer von Neuronen im ventrolateralen periaquäduktalen Grau – einer Hirnstammregion, die während des REM-Schlafs (Rapid Eye Movement) inaktiv ist – vor und während der Vollnarkose zu messen.

Abstract

Silizium-Multielektroden-basierte Aufzeichnungen werden immer beliebter, um die neuronale Aktivität bei der zeitlichen Auflösung von Aktionspotentialen in vielen Hirnregionen zu untersuchen. Die Aufzeichnung der neuronalen Aktivität von tiefen kaudalen Strukturen wie dem Hirnstamm mit Mehrkanalsonden bleibt jedoch eine Herausforderung. Ein wesentliches Anliegen ist es, einen Pfad für das Einführen der Sonde zu finden, der große Blutgefäße wie den oberen sagittalen Venensinus und den transversalen Venensinus vermeidet. Eine Verletzung dieser großen Venen kann zu starken Blutungen, Schäden am darunter liegenden Hirngewebe und möglicherweise zum Tod führen. Dieser Ansatz beschreibt das Targeting von Hirnstammstrukturen, indem anteriore Koordinaten mit einem abgewinkelten Ansatz gekoppelt werden, wodurch die Aufzeichnungssonde das Gehirn unterhalb von Gefäßstrukturen mit hohem Risiko durchdringen kann. Im Vergleich zu einem streng vertikalen Ansatz maximiert der abgewinkelte Ansatz die Anzahl der Gehirnregionen, die anvisiert werden können. Mit dieser Strategie kann reproduzierbar und zuverlässig auf das ventrolaterale periaquäduktale Grau (vlPAG), eine Hirnstammregion, die mit dem REM-Schlaf assoziiert ist, zugegriffen werden, um Einzel-, Mehrelektroden-Aufzeichnungen bei Mäusen mit fixiertem Kopf vor und während der Sevofluran-Anästhesie zu erhalten. Die Möglichkeit, die neuronale Aktivität im vlPAG und den umgebenden Kernen mit hoher zeitlicher Auflösung aufzuzeichnen, ist ein Schritt nach vorne, um das Verständnis der Beziehung zwischen REM-Schlaf und Anästhesie zu verbessern.

Introduction

Silizium-Multielektroden-basierte Aufzeichnungen werden immer beliebter, um die neuronale Aktivität in vielen Gehirnregionen mit einer Auflösung von Einzelaktionspotentialenzu messen 1,2,3,4. In den letzten zehn Jahren hat die High-Density-Recording-Technologie erheblich zugenommen. Aktuelle Aufzeichnungselektroden auf Silizium können hohe Kanalzahlen, optische Fasern und Elektrokortikographie-Aufzeichnungsgeräte (ECoG) aufnehmen 5,6. Darüber hinaus ermöglicht die chronische Implantation dieser Elektroden Langzeitaufzeichnungen 7,8.

Trotz der jüngsten technologischen Fortschritte bleibt es eine Herausforderung, tiefe kaudale Strukturen wie den Hirnstamm mit Mehrkanalsonden zu erreichen. Bei der Ausrichtung auf Hirnstammstrukturen wie das ventrolaterale periakquäduktale Grau (vlPAG) besteht ein wesentliches Hindernis darin, eine Sondentrajektorie zu identifizieren, die wichtige Blutgefäße vermeidet, z. B. den Sinus sagittalis superior und den venösen Sinus transversal. Eine Verletzung dieser großen Venen kann zu starken Blutungen, Schäden am darunter liegenden Hirngewebe und sogar zum Tod führen 9,10. Wir schlagen vor, Hirnstammstrukturen von anterioren Koordinaten aus in einem Winkel anzuvisieren, so dass die Aufzeichnungssonde das Gehirn unterhalb solcher hochriskanten Gefäßstrukturen durchdringen kann (siehe Abbildung 1). Dieser abgewinkelte Ansatz maximiert im Vergleich zu einem vertikalen Ansatz die Anzahl der Gehirnregionen, die für die Aufzeichnung zugänglich sind. Darüber hinaus bietet der abgewinkelte anteriore Zugang unter experimentellen Bedingungen, in denen ECoG-Aufzeichnungen gewünscht sind, mehr Schädeloberfläche für die Implantation des ECoG-Headsets, da das Kraniotomiefenster für das Einführen der Sonde weiter nach vorne positioniert ist10,11.

Die Identifizierung der spezifischen Zellgruppen und Schaltkreise, die für anästhesieinduzierte REM-Schlafveränderungen verantwortlich sind, bleibt ein wichtiges Ziel der Anästhesieforschung. Daher bestand das Ziel darin, reproduzierbar und zuverlässig auf das vlPAG – eine Hirnstammregion, die mit dem REM-Schlaf assoziiert ist – zuzugreifen, um Einzel-Mehrelektroden-Aufzeichnungen in Maus mit fixiertem Kopf vor und während der Sevofluran-Anästhesie zu erhalten12,13. Frühere Studien haben elektrophysiologische LFP-Messungen (Local Field Potential) des vlPAG bei wachen Mäusen verwendet, um Veränderungen des neuronalen Zustands im Zusammenhang mit der Anästhesie zu identifizieren14,15. LFP-Messungen sind jedoch in erster Linie empfindlich gegenüber synaptischer Aktivität, nicht auf Aktionspotentialen, innerhalb des aufgezeichneten Bereichs16. Folglich gibt es nach wie vor ein begrenztes Verständnis darüber, wie Anästhetika die von vlPAG-Neuronen produzierten neuronalen Aktivitätsmuster direkt beeinflussen. Hier wird ein Verfahren beschrieben, um High-Density-Einzelneuronen-Ableitungen aus dem Hirnstamm von kopffixierten Mäusen zu erhalten. Diese Methode kann auch angepasst werden, um die Aktivität einzelner Neuronen aus verschiedenen anderen tiefen und hinteren Hirnstammstrukturen aufzuzeichnen.

Protocol

Alle Studien wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der University of Virginia (Charlottesville, Virginia) genehmigt. Es wurden fünf männliche C57BL/6J-Mäuse im Alter von 3-7 Monaten mit einem Gewicht von 25-30 g verwendet. Die Details zu den hier verwendeten Reagenzien und Geräten sind in der Materialtabelle aufgeführt. 1. Implantation der Kopfplatte und des Headsets Stellen Sie ein ECoG-Headset…

Representative Results

Fünf männlichen C57BL/6J wurden ein ECoG-Headset und eine Kopfplatte implantiert (Abbildung 4A). Nach der Genesung wurden die Mäuse während zweier 1,5-stündiger Sitzungen an verschiedenen Tagen an die Kopffixation und das elektrophysiologische Aufzeichnungssystem gewöhnt (Abbildung 4B). Als nächstes wurde ein 2 mm x 2 mm großes Kraniotomiefenster erstellt (Abbildung 4C) und eine Silikonsonde…

Discussion

Hirnstammkerne vermitteln grundlegende Funktionen wie Atmung, Bewusstsein und Schlaf 26,27,28. Die Lage des Hirnstamms (tief und posterior) stellt eine Herausforderung dar, wenn es darum geht, seine neuronale Aktivität in vivo mit Standardtechniken zu untersuchen. Hier wird ein abgewinkelter anteriorer Zugang vorgestellt, um eine reproduzierbare Einzelaufzeichnung bei kopffixierten Mä…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Abbildung 1, Abbildung 3, Abbildung 4, Abbildung 8 und Abbildung 9 wurden mit BioRender.com erstellt. Wir bedanken uns bei Scott Kilianski für die Hilfe mit dem MATLAB-Code und das Teilen seiner Skripte. Wir danken Anna Grace Carns für die Hilfe bei der Rekonstruktion der Sondenbahn.

Materials

1024 channel RHD Recording Controller Intan Technologies, Los Angeles, California, USA C3008 Silicon probe recording; recording hardware and software
24 mm x 50 mm No. 1.5 VWR coverslip VWR, Radnor, Pennsylvania, USA 48393-081 Histology
4% PFA in PBS ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA J61899.AK Histology; perfusion solution
C&B metabond Patterson Dental, Richmond, Virginia, USA powder: 5533559, quick base: 5533492, catalyst: 55335007 Headplate &Headset Implantation
C57/6J mice 4-6 weeks, males The Jackson Laboratory, Bar Harbor, Maine, USA 000664
Capnomac Ultima Datex, Helsinki, Finland  ULT-SVi-27-07 Gas Analyzer; discontinued; alternative gas analyzer can be purchased from Bionet America 
CM-DiI ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA V22888 Red fluorescent dye for coating of the silicon probe
Connector Header DigiKey, Thief River Falls, Minnesota, USA 1212-1788-ND ECoG Headset
DAPI Fluoromount-G SouthernBiotech, Birmingham, Alabama, USA 0100-20 Histology
iBOND Universal Patterson Dental, Richmond, Virginia, USA 044-1113 Headplate &Headset Implantation; for  securing stainless steel wires to the skull
Low toxicity silicon adhesive World Precision Instruments, Sarasota, Florida, USA KWIK-SIL Headplate
Micro-Manipulator System New Scale Technologies, Victor, New York, USA Multi-Probe Manipulator: XYZ Stage Assembly: 06464-0000, MPM System Kit: 06267-3-0001, MPM-Platform-360, MPM ring for MPM Manual Arms, MPM_Ring-72 DEG: 06262-3-0000 Silicon probe recording; inserting the probe into the brain
Microprobes UCLA, Los Angeles, California, USA 256 ANS, 64M Discontinued; alternative silicon probes can be purchased from Neuropixels
Mineral Oil Sigma Aldrich, Saint Luis, Missouri, USA M8410-100ML Silicon probe recording; preventing the tissue from drying during the recording
Normal saline ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA Z1376 Headplate &Headset Implantation; preventing the brain from drying during the surgery
PFA-Coated Stainless Steel Wire-Diameter 0.008 in. coated with striped ends A-M systems, Sequim, Washington, USA 791400 ECoG Headset & reference electrode for ECoG 
Platinum wire 24AWG  World Precision Instruments, Sarasota, Florida, USA PTP201 Reference electrode for the silicon probe recording 
Shandon Colorfrost Plus microscope slides ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA 99-910-01 Histology
Stainless steel Headplate Star Rapid, China custom made part Headplate &Headset Implantation; design available upon request
Stereotaxic apparatus KOPF, Tujunga, California, USA Model 940 Small Animal Stereotaxic Instrument with Digital Display Console Headplate &Headset Implantation

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Diesen Artikel zitieren
Pikus, M., Dulko, E., Beenhakker, M., Lunardi, N. Acute Single-Unit Multi-Electrode Recordings from the Brainstem of Head-Fixed Mice. J. Vis. Exp. (212), e67205, doi:10.3791/67205 (2024).

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