Dieses Protokoll beschreibt eine Methode, um in vivo Einzelneuronen-Aufzeichnungen mit hoher Dichte aus dem Hirnstamm von kopffixierten Mäusen zu erhalten. Dieser Ansatz wird eingesetzt, um das Aktionspotentialfeuer von Neuronen im ventrolateralen periaquäduktalen Grau – einer Hirnstammregion, die während des REM-Schlafs (Rapid Eye Movement) inaktiv ist – vor und während der Vollnarkose zu messen.
Silizium-Multielektroden-basierte Aufzeichnungen werden immer beliebter, um die neuronale Aktivität bei der zeitlichen Auflösung von Aktionspotentialen in vielen Hirnregionen zu untersuchen. Die Aufzeichnung der neuronalen Aktivität von tiefen kaudalen Strukturen wie dem Hirnstamm mit Mehrkanalsonden bleibt jedoch eine Herausforderung. Ein wesentliches Anliegen ist es, einen Pfad für das Einführen der Sonde zu finden, der große Blutgefäße wie den oberen sagittalen Venensinus und den transversalen Venensinus vermeidet. Eine Verletzung dieser großen Venen kann zu starken Blutungen, Schäden am darunter liegenden Hirngewebe und möglicherweise zum Tod führen. Dieser Ansatz beschreibt das Targeting von Hirnstammstrukturen, indem anteriore Koordinaten mit einem abgewinkelten Ansatz gekoppelt werden, wodurch die Aufzeichnungssonde das Gehirn unterhalb von Gefäßstrukturen mit hohem Risiko durchdringen kann. Im Vergleich zu einem streng vertikalen Ansatz maximiert der abgewinkelte Ansatz die Anzahl der Gehirnregionen, die anvisiert werden können. Mit dieser Strategie kann reproduzierbar und zuverlässig auf das ventrolaterale periaquäduktale Grau (vlPAG), eine Hirnstammregion, die mit dem REM-Schlaf assoziiert ist, zugegriffen werden, um Einzel-, Mehrelektroden-Aufzeichnungen bei Mäusen mit fixiertem Kopf vor und während der Sevofluran-Anästhesie zu erhalten. Die Möglichkeit, die neuronale Aktivität im vlPAG und den umgebenden Kernen mit hoher zeitlicher Auflösung aufzuzeichnen, ist ein Schritt nach vorne, um das Verständnis der Beziehung zwischen REM-Schlaf und Anästhesie zu verbessern.
Silizium-Multielektroden-basierte Aufzeichnungen werden immer beliebter, um die neuronale Aktivität in vielen Gehirnregionen mit einer Auflösung von Einzelaktionspotentialenzu messen 1,2,3,4. In den letzten zehn Jahren hat die High-Density-Recording-Technologie erheblich zugenommen. Aktuelle Aufzeichnungselektroden auf Silizium können hohe Kanalzahlen, optische Fasern und Elektrokortikographie-Aufzeichnungsgeräte (ECoG) aufnehmen 5,6. Darüber hinaus ermöglicht die chronische Implantation dieser Elektroden Langzeitaufzeichnungen 7,8.
Trotz der jüngsten technologischen Fortschritte bleibt es eine Herausforderung, tiefe kaudale Strukturen wie den Hirnstamm mit Mehrkanalsonden zu erreichen. Bei der Ausrichtung auf Hirnstammstrukturen wie das ventrolaterale periakquäduktale Grau (vlPAG) besteht ein wesentliches Hindernis darin, eine Sondentrajektorie zu identifizieren, die wichtige Blutgefäße vermeidet, z. B. den Sinus sagittalis superior und den venösen Sinus transversal. Eine Verletzung dieser großen Venen kann zu starken Blutungen, Schäden am darunter liegenden Hirngewebe und sogar zum Tod führen 9,10. Wir schlagen vor, Hirnstammstrukturen von anterioren Koordinaten aus in einem Winkel anzuvisieren, so dass die Aufzeichnungssonde das Gehirn unterhalb solcher hochriskanten Gefäßstrukturen durchdringen kann (siehe Abbildung 1). Dieser abgewinkelte Ansatz maximiert im Vergleich zu einem vertikalen Ansatz die Anzahl der Gehirnregionen, die für die Aufzeichnung zugänglich sind. Darüber hinaus bietet der abgewinkelte anteriore Zugang unter experimentellen Bedingungen, in denen ECoG-Aufzeichnungen gewünscht sind, mehr Schädeloberfläche für die Implantation des ECoG-Headsets, da das Kraniotomiefenster für das Einführen der Sonde weiter nach vorne positioniert ist10,11.
Die Identifizierung der spezifischen Zellgruppen und Schaltkreise, die für anästhesieinduzierte REM-Schlafveränderungen verantwortlich sind, bleibt ein wichtiges Ziel der Anästhesieforschung. Daher bestand das Ziel darin, reproduzierbar und zuverlässig auf das vlPAG – eine Hirnstammregion, die mit dem REM-Schlaf assoziiert ist – zuzugreifen, um Einzel-Mehrelektroden-Aufzeichnungen in Maus mit fixiertem Kopf vor und während der Sevofluran-Anästhesie zu erhalten12,13. Frühere Studien haben elektrophysiologische LFP-Messungen (Local Field Potential) des vlPAG bei wachen Mäusen verwendet, um Veränderungen des neuronalen Zustands im Zusammenhang mit der Anästhesie zu identifizieren14,15. LFP-Messungen sind jedoch in erster Linie empfindlich gegenüber synaptischer Aktivität, nicht auf Aktionspotentialen, innerhalb des aufgezeichneten Bereichs16. Folglich gibt es nach wie vor ein begrenztes Verständnis darüber, wie Anästhetika die von vlPAG-Neuronen produzierten neuronalen Aktivitätsmuster direkt beeinflussen. Hier wird ein Verfahren beschrieben, um High-Density-Einzelneuronen-Ableitungen aus dem Hirnstamm von kopffixierten Mäusen zu erhalten. Diese Methode kann auch angepasst werden, um die Aktivität einzelner Neuronen aus verschiedenen anderen tiefen und hinteren Hirnstammstrukturen aufzuzeichnen.
Hirnstammkerne vermitteln grundlegende Funktionen wie Atmung, Bewusstsein und Schlaf 26,27,28. Die Lage des Hirnstamms (tief und posterior) stellt eine Herausforderung dar, wenn es darum geht, seine neuronale Aktivität in vivo mit Standardtechniken zu untersuchen. Hier wird ein abgewinkelter anteriorer Zugang vorgestellt, um eine reproduzierbare Einzelaufzeichnung bei kopffixierten Mä…
The authors have nothing to disclose.
Abbildung 1, Abbildung 3, Abbildung 4, Abbildung 8 und Abbildung 9 wurden mit BioRender.com erstellt. Wir bedanken uns bei Scott Kilianski für die Hilfe mit dem MATLAB-Code und das Teilen seiner Skripte. Wir danken Anna Grace Carns für die Hilfe bei der Rekonstruktion der Sondenbahn.
1024 channel RHD Recording Controller | Intan Technologies, Los Angeles, California, USA | C3008 | Silicon probe recording; recording hardware and software | |
24 mm x 50 mm No. 1.5 VWR coverslip | VWR, Radnor, Pennsylvania, USA | 48393-081 | Histology | |
4% PFA in PBS | ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | J61899.AK | Histology; perfusion solution | |
C&B metabond | Patterson Dental, Richmond, Virginia, USA | powder: 5533559, quick base: 5533492, catalyst: 55335007 | Headplate &Headset Implantation | |
C57/6J mice 4-6 weeks, males | The Jackson Laboratory, Bar Harbor, Maine, USA | 000664 | ||
Capnomac Ultima | Datex, Helsinki, Finland | ULT-SVi-27-07 | Gas Analyzer; discontinued; alternative gas analyzer can be purchased from Bionet America | |
CM-DiI | ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | V22888 | Red fluorescent dye for coating of the silicon probe | |
Connector Header | DigiKey, Thief River Falls, Minnesota, USA | 1212-1788-ND | ECoG Headset | |
DAPI Fluoromount-G | SouthernBiotech, Birmingham, Alabama, USA | 0100-20 | Histology | |
iBOND Universal | Patterson Dental, Richmond, Virginia, USA | 044-1113 | Headplate &Headset Implantation; for securing stainless steel wires to the skull | |
Low toxicity silicon adhesive | World Precision Instruments, Sarasota, Florida, USA | KWIK-SIL | Headplate | |
Micro-Manipulator System | New Scale Technologies, Victor, New York, USA | Multi-Probe Manipulator: XYZ Stage Assembly: 06464-0000, MPM System Kit: 06267-3-0001, MPM-Platform-360, MPM ring for MPM Manual Arms, MPM_Ring-72 DEG: 06262-3-0000 | Silicon probe recording; inserting the probe into the brain | |
Microprobes | UCLA, Los Angeles, California, USA | 256 ANS, 64M | Discontinued; alternative silicon probes can be purchased from Neuropixels | |
Mineral Oil | Sigma Aldrich, Saint Luis, Missouri, USA | M8410-100ML | Silicon probe recording; preventing the tissue from drying during the recording | |
Normal saline | ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | Z1376 | Headplate &Headset Implantation; preventing the brain from drying during the surgery | |
PFA-Coated Stainless Steel Wire-Diameter 0.008 in. coated with striped ends | A-M systems, Sequim, Washington, USA | 791400 | ECoG Headset & reference electrode for ECoG | |
Platinum wire 24AWG | World Precision Instruments, Sarasota, Florida, USA | PTP201 | Reference electrode for the silicon probe recording | |
Shandon Colorfrost Plus microscope slides | ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 99-910-01 | Histology | |
Stainless steel Headplate | Star Rapid, China | custom made part | Headplate &Headset Implantation; design available upon request | |
Stereotaxic apparatus | KOPF, Tujunga, California, USA | Model 940 Small Animal Stereotaxic Instrument with Digital Display Console | Headplate &Headset Implantation |
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