このプロトコルは、頭部固定マウスの脳幹から in vivoで高密度の単一ニューロン記録を取得する方法を説明する。このアプローチは、全身麻酔前および全身麻酔中に、腹外側水道周囲灰色 (急速眼球運動 (REM) 睡眠中に不活性な脳幹領域) のニューロンの活動電位発火を測定するために展開されます。
シリコン多電極ベースの記録は、多くの脳領域における活動電位の時間分解能でニューロン活動を研究するためにますます人気が高まっています。しかし、マルチチャネルプローブを使用して脳幹のような深部尾側構造からのニューロン活動を記録することは依然として困難です。大きな懸念事項は、上矢状静脈洞や横静脈洞などの大きな血管を避けるプローブ挿入の軌道を見つけることです。これらの大きな静脈を損傷すると、広範な出血、下にある脳組織の損傷、そして潜在的に死に至る可能性があります。このアプローチでは、前座標と角度付きアプローチを結合して脳幹構造を標的とし、記録プローブが高リスク血管構造の下の脳を貫通できるようにする方法を説明しています。厳密に垂直なアプローチと比較して、角度付きアプローチは、ターゲットにできる脳領域の数を最大化します。この戦略を使用すると、レム睡眠に関連する脳幹領域である腹外側脳水道周囲灰色 (vlPAG) に再現性があり確実にアクセスして、セボフルラン麻酔前および麻酔中に頭部固定マウスで単一ユニットの多電極記録を取得できます。vlPAGおよび周囲の核のニューロン活動を高い時間分解能で記録する能力は、レム睡眠と麻酔の関係の理解を前進させる一歩です。
シリコンマルチ電極ベースの記録は、単一活動電位分解能1,2,3,4で多くの脳領域にわたるニューロン活動を測定するためにますます人気が高まっています。この10年間で、高密度記録技術は大幅に進歩しました。現在のシリコンベースの記録電極は、多チャンネル数、光ファイバー、および皮質電図(ECoG)記録デバイス5,6に対応できます。さらに、これらの電極の慢性的な埋め込みは、長期記録7,8を可能にする。
近年の技術の進歩にもかかわらず、マルチチャネルプローブで脳幹のような深部尾側構造を標的とすることは依然として困難です。腹外側脳水道周囲灰色(vlPAG)などの脳幹構造を標的とする場合、大きな障害の1つは、主要な血管(上矢状静脈洞や横静脈洞など)を回避するプローブ軌道を特定することです。これらの大きな静脈の損傷は、広範な出血、下にある脳組織の損傷、さらには死を引き起こす可能性があります9,10。私たちは、斜めに前方座標から脳幹構造を標的とすることを提案します。これにより、記録プローブはそのような高リスク血管構造の下の脳を貫通できます(図1を参照)。この角度付きアプローチは、垂直アプローチと比較して、記録可能な脳領域の数を最大化します。さらに、ECoG記録が望まれる実験状況では、プローブ挿入のための開頭窓がより前方に配置されるため、角度のある前方アプローチにより、ECoGヘッドセットの埋め込みに利用できる頭蓋骨表面が大きくなります10,11。
麻酔によるレム睡眠の変化に関与する特定の細胞群と回路を特定することは、依然として麻酔研究の主要な目標です。したがって、ここでの目的は、レム睡眠に関連する脳幹領域であるvlPAGに再現性があり確実にアクセスして、セボフルラン麻酔前および麻酔中の頭部固定マウスで単一ユニットの多電極記録を取得することでした12,13。以前の研究では、覚醒マウスのvlPAGの電気生理学的局所電位(LFP)測定を使用して、麻酔14,15に関連する神経状態の変化を特定しています。しかし、LFP測定は、記録された領域16内の活動電位ではなく、主にシナプス活動に敏感である。したがって、麻酔薬がvlPAGニューロンによって生成される神経活動パターンに直接影響を与える方法についての理解は限られています。ここでは、頭部固定マウスの脳幹から高密度の単一ニューロン記録を得る方法について説明する。この方法は、他のさまざまな深部および後部脳幹構造からの単一ニューロン活動を記録するようにも適応できます。
脳幹核は、呼吸、意識、睡眠などの基本的な機能を媒介する26,27,28。脳幹の位置(深部および後部)は、標準的な技術を使用してin vivoでそのニューロン活動を研究する上で課題となります。ここでは、頭部固定マウスでの再現性のある単一ユニット記録を可能にするために、角度付き前方アプ…
The authors have nothing to disclose.
図 1、 図 3、 図 4、 図 8 、 図 9 は BioRender.com を使用して作成されました。MATLAB コードのサポートとスクリプトの共有にご協力いただいた Scott Kilianski に感謝いたします。プローブ軌道の再構築に協力してくれたAnna Grace Carnsに感謝します。
1024 channel RHD Recording Controller | Intan Technologies, Los Angeles, California, USA | C3008 | Silicon probe recording; recording hardware and software | |
24 mm x 50 mm No. 1.5 VWR coverslip | VWR, Radnor, Pennsylvania, USA | 48393-081 | Histology | |
4% PFA in PBS | ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | J61899.AK | Histology; perfusion solution | |
C&B metabond | Patterson Dental, Richmond, Virginia, USA | powder: 5533559, quick base: 5533492, catalyst: 55335007 | Headplate &Headset Implantation | |
C57/6J mice 4-6 weeks, males | The Jackson Laboratory, Bar Harbor, Maine, USA | 000664 | ||
Capnomac Ultima | Datex, Helsinki, Finland | ULT-SVi-27-07 | Gas Analyzer; discontinued; alternative gas analyzer can be purchased from Bionet America | |
CM-DiI | ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | V22888 | Red fluorescent dye for coating of the silicon probe | |
Connector Header | DigiKey, Thief River Falls, Minnesota, USA | 1212-1788-ND | ECoG Headset | |
DAPI Fluoromount-G | SouthernBiotech, Birmingham, Alabama, USA | 0100-20 | Histology | |
iBOND Universal | Patterson Dental, Richmond, Virginia, USA | 044-1113 | Headplate &Headset Implantation; for securing stainless steel wires to the skull | |
Low toxicity silicon adhesive | World Precision Instruments, Sarasota, Florida, USA | KWIK-SIL | Headplate | |
Micro-Manipulator System | New Scale Technologies, Victor, New York, USA | Multi-Probe Manipulator: XYZ Stage Assembly: 06464-0000, MPM System Kit: 06267-3-0001, MPM-Platform-360, MPM ring for MPM Manual Arms, MPM_Ring-72 DEG: 06262-3-0000 | Silicon probe recording; inserting the probe into the brain | |
Microprobes | UCLA, Los Angeles, California, USA | 256 ANS, 64M | Discontinued; alternative silicon probes can be purchased from Neuropixels | |
Mineral Oil | Sigma Aldrich, Saint Luis, Missouri, USA | M8410-100ML | Silicon probe recording; preventing the tissue from drying during the recording | |
Normal saline | ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | Z1376 | Headplate &Headset Implantation; preventing the brain from drying during the surgery | |
PFA-Coated Stainless Steel Wire-Diameter 0.008 in. coated with striped ends | A-M systems, Sequim, Washington, USA | 791400 | ECoG Headset & reference electrode for ECoG | |
Platinum wire 24AWG | World Precision Instruments, Sarasota, Florida, USA | PTP201 | Reference electrode for the silicon probe recording | |
Shandon Colorfrost Plus microscope slides | ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 99-910-01 | Histology | |
Stainless steel Headplate | Star Rapid, China | custom made part | Headplate &Headset Implantation; design available upon request | |
Stereotaxic apparatus | KOPF, Tujunga, California, USA | Model 940 Small Animal Stereotaxic Instrument with Digital Display Console | Headplate &Headset Implantation |
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