Este protocolo describe un método para obtener grabaciones in vivo de una sola neurona de alta densidad a partir del tronco encefálico de ratones con cabeza fija. Este enfoque se implementa para medir el potencial de acción de las neuronas en el gris periacueductal ventrolateral, una región del tronco encefálico inactiva durante el sueño de movimiento ocular rápido (REM), antes y durante la anestesia general.
Las grabaciones basadas en multielectrodos de silicio son cada vez más populares para estudiar la actividad neuronal en la resolución temporal de los potenciales de acción en muchas regiones del cerebro. Sin embargo, el registro de la actividad neuronal de las estructuras caudales profundas, como el tronco encefálico, mediante sondas multicanal sigue siendo un reto. Una preocupación importante es encontrar una trayectoria para la inserción de la sonda que evite los vasos sanguíneos grandes, como el seno venoso sagital superior y el seno venoso transverso. Lesionar estas venas grandes puede causar sangrado extenso, daño al tejido cerebral subyacente y potencialmente la muerte. Este enfoque describe el objetivo de las estructuras del tronco encefálico mediante el acoplamiento de las coordenadas anteriores con un enfoque en ángulo, lo que permite que la sonda de registro penetre en el cerebro por debajo de las estructuras vasculares de alto riesgo. En comparación con un enfoque estrictamente vertical, el enfoque en ángulo maximiza el número de regiones del cerebro que se pueden objetivo. Con esta estrategia, se puede acceder de forma reproducible y fiable al gris periacueductal ventrolateral (vlPAG), una región del tronco encefálico asociada con el sueño REM, para obtener registros de múltiples electrodos de una sola unidad en ratones con cabeza fijada antes y durante la anestesia con sevoflurano. La capacidad de registrar la actividad neuronal en el vlPAG y los núcleos circundantes con alta resolución temporal es un paso adelante en la comprensión de la relación entre el sueño REM y la anestesia.
Las grabaciones basadas en múltiples electrodos de silicio se están volviendo cada vez más populares para medir la actividad neuronal en muchas regiones del cerebro con una resolución de potencial de acción única 1,2,3,4. En la última década, la tecnología de grabación de alta densidad ha crecido considerablemente. Los electrodos de registro actuales basados en silicio pueden acomodar grandes recuentos de canales, fibras ópticas y dispositivos de registro de electrocorticografía (ECoG) 5,6. Además, la implantación crónica de estos electrodos permite registros a largo plazo 7,8.
A pesar de los recientes avances tecnológicos, seguir apuntando a las estructuras caudales profundas, como el tronco encefálico, con sondas multicanal sigue siendo un reto. Cuando se dirigen a las estructuras del tronco encefálico, como el gris periacueductal ventrolateral (vlPAG), un obstáculo importante es identificar una trayectoria de sonda que evite los vasos sanguíneos principales, por ejemplo, el seno venoso sagital superior y el seno venoso transverso. Las lesiones en estas venas grandes pueden causar sangrado extenso, daño al tejido cerebral subyacente e incluso la muerte 9,10. Proponemos apuntar a las estructuras del tronco encefálico desde las coordenadas anteriores en un ángulo, permitiendo que la sonda de registro penetre en el cerebro por debajo de estas estructuras vasculares de alto riesgo (ver Figura 1). Este enfoque en ángulo, en comparación con uno vertical, maximiza el número de regiones cerebrales accesibles para el registro. Además, en circunstancias experimentales en las que se desean registros de ECoG, el abordaje anterior en ángulo proporciona más superficie craneal disponible para la implantación de auriculares ECoG, ya que la ventana de craneotomía para la inserción de la sonda se coloca más anteriormente10,11.
La identificación de los grupos celulares y circuitos específicos responsables de los cambios en el sueño REM inducidos por la anestesia sigue siendo un objetivo importante de la investigación sobre anestesia. Por lo tanto, el objetivo fue acceder de manera reproducible y confiable al vlPAG, una región del tronco encefálico asociada con el sueño REM, para obtener registros de electrodos individuales y múltiples electrodos en ratones con cabeza fijada antes y durante la anestesia con sevoflurano12,13. Estudios previos han utilizado mediciones electrofisiológicas del potencial de campo local (LFP) del vlPAG en ratones despiertos para identificar los cambios de estado neuronal asociados con la anestesia14,15. Sin embargo, las mediciones de LFP son principalmente sensibles a la actividad sináptica, no a los potenciales de acción, dentro del área registrada16. En consecuencia, sigue habiendo una comprensión limitada de cómo los anestésicos afectan directamente a los patrones de actividad neuronal producidos por las neuronas vlPAG. Aquí, se describe un método para obtener grabaciones de una sola neurona de alta densidad a partir del tronco encefálico de ratones con cabeza fija. Este método también se puede adaptar para registrar la actividad de una sola neurona de varias otras estructuras profundas y posteriores del tronco encefálico.
Los núcleos del tronco encefálico median funciones fundamentales como la respiración, la conciencia y el sueño 26,27,28. La localización del tronco encefálico (profunda y posterior) presenta un reto a la hora de estudiar su actividad neuronal in vivo utilizando técnicas estándar. Aquí se presenta un abordaje anterior en ángulo para permitir el registro reproducible de una sola…
The authors have nothing to disclose.
La Figura 1, la Figura 3, la Figura 4, la Figura 8 y la Figura 9 se crearon con BioRender.com. Nos gustaría agradecer a Scott Kilianski por su ayuda con el código de MATLAB y por compartir sus scripts. Agradecemos a Anna Grace Carns por la ayuda con la reconstrucción de la trayectoria de la sonda.
1024 channel RHD Recording Controller | Intan Technologies, Los Angeles, California, USA | C3008 | Silicon probe recording; recording hardware and software | |
24 mm x 50 mm No. 1.5 VWR coverslip | VWR, Radnor, Pennsylvania, USA | 48393-081 | Histology | |
4% PFA in PBS | ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | J61899.AK | Histology; perfusion solution | |
C&B metabond | Patterson Dental, Richmond, Virginia, USA | powder: 5533559, quick base: 5533492, catalyst: 55335007 | Headplate &Headset Implantation | |
C57/6J mice 4-6 weeks, males | The Jackson Laboratory, Bar Harbor, Maine, USA | 000664 | ||
Capnomac Ultima | Datex, Helsinki, Finland | ULT-SVi-27-07 | Gas Analyzer; discontinued; alternative gas analyzer can be purchased from Bionet America | |
CM-DiI | ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | V22888 | Red fluorescent dye for coating of the silicon probe | |
Connector Header | DigiKey, Thief River Falls, Minnesota, USA | 1212-1788-ND | ECoG Headset | |
DAPI Fluoromount-G | SouthernBiotech, Birmingham, Alabama, USA | 0100-20 | Histology | |
iBOND Universal | Patterson Dental, Richmond, Virginia, USA | 044-1113 | Headplate &Headset Implantation; for securing stainless steel wires to the skull | |
Low toxicity silicon adhesive | World Precision Instruments, Sarasota, Florida, USA | KWIK-SIL | Headplate | |
Micro-Manipulator System | New Scale Technologies, Victor, New York, USA | Multi-Probe Manipulator: XYZ Stage Assembly: 06464-0000, MPM System Kit: 06267-3-0001, MPM-Platform-360, MPM ring for MPM Manual Arms, MPM_Ring-72 DEG: 06262-3-0000 | Silicon probe recording; inserting the probe into the brain | |
Microprobes | UCLA, Los Angeles, California, USA | 256 ANS, 64M | Discontinued; alternative silicon probes can be purchased from Neuropixels | |
Mineral Oil | Sigma Aldrich, Saint Luis, Missouri, USA | M8410-100ML | Silicon probe recording; preventing the tissue from drying during the recording | |
Normal saline | ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | Z1376 | Headplate &Headset Implantation; preventing the brain from drying during the surgery | |
PFA-Coated Stainless Steel Wire-Diameter 0.008 in. coated with striped ends | A-M systems, Sequim, Washington, USA | 791400 | ECoG Headset & reference electrode for ECoG | |
Platinum wire 24AWG | World Precision Instruments, Sarasota, Florida, USA | PTP201 | Reference electrode for the silicon probe recording | |
Shandon Colorfrost Plus microscope slides | ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 99-910-01 | Histology | |
Stainless steel Headplate | Star Rapid, China | custom made part | Headplate &Headset Implantation; design available upon request | |
Stereotaxic apparatus | KOPF, Tujunga, California, USA | Model 940 Small Animal Stereotaxic Instrument with Digital Display Console | Headplate &Headset Implantation |
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