Summary

Eozinofilik Özofajitte Epitel Bariyerini Araştırmak İçin Üç Boyutlu Hücre Kültürü Modelleri

Published: May 10, 2024
doi:

Summary

Burada, insan özofagus organoidlerinin kültürü ve hava-sıvı arayüz kültürü için bir protokol sağlanmıştır. Özofagus organoidlerinin hava-sıvı arayüz kültürü, sitokinlerin özofagus epitel bariyeri üzerindeki etkisini incelemek için kullanılabilir.

Abstract

Özofagusun skuamöz epiteli doğrudan çevreye maruz kalır ve sürekli olarak gıda antijenleri ve mikroplar dahil olmak üzere yabancı antijenlerle karşı karşıya kalır. Epitel bariyerinin bütünlüğünün korunması, enfeksiyonları önlemek ve zararsız gıda kaynaklı antijenlerin neden olduğu iltihaplanmayı önlemek için kritik öneme sahiptir. Bu makale, doku homeostazı ve hastalığı bağlamında özofagusun epitel kompartmanını incelemek için hasta biyopsilerinden insan özofagus organoidleri ve hava-sıvı arayüz kültürleri oluşturmak için basitleştirilmiş protokoller sunmaktadır. Bu protokoller, son on yılda, hastadan türetilen birincil hücrelerden, organoidlerden ve hava-sıvı arayüz kültürlerinden üç boyutlu organ benzeri yapıları tanımlayan önemli bilimsel kilometre taşları olmuştur. Donörün fenotipik ve genetik özelliklerini korurken, özofagus epitelinde spesifik sitokinlerin, büyüme faktörlerinin ve sinyal yollarının işlevini üç boyutlu bir çerçeve içinde araştırma imkanı sunarlar. Organoidler, sitokin stimülasyonu sonrası transkriptom ve proteomu değerlendirerek doku mikromimarisi hakkında bilgi sağlar. Buna karşılık, hava-sıvı arayüz kültürleri, transepitelyal direnç (TEER) veya makromolekül akı ölçümleri yoluyla epitel bariyer bütünlüğünün değerlendirilmesine izin verir. Bu organoidleri ve hava-sıvı arayüz kültürlerini birleştirmek, bozulmuş özofagus epitel bariyeri koşullarında araştırmaları ilerletmek için güçlü bir araçtır.

Introduction

Özofagus iltihabı, özofagusun Th2 baskın kronik inflamatuar bir hastalığı olan eozinofilik özofajitte (EoE) gözlendiği gibi epitel bariyer bütünlüğünü 1,2,3,4,5 tehlikeye atar 6. EoE ilk olarak 1990’larda 7,8 tanımlanmıştır ve ağırlıklı olarak gıda antijenleri 9,10,11,12,13 tarafından indüklenmiştir. Yetişkin popülasyonda en sık görülen EoE semptomları disfaji ve gıda etkisidir14. Çocuklarda, EoE tipik olarak gelişememe, gıda reddi, kusma ve karın ağrısı ile kendini gösterir15. Genom çapında ilişkilendirme çalışmaları (GWAS), epitel bariyer bütünlüğünde yer alan EoE risk genlerini tanımlamış ve epiteli EoE araştırmasının odak noktasına taşımıştır 16,17,18. EoE transkriptomikleri ayrıca, bozulmuş bir farklılaşma sürecinin ve reaktif bir bazal bölge hiperplazisinin, özofagus epitelinin 3,5,19,20,21,22 bozulmuş bariyer fonksiyonuna neden olduğunu ortaya koydu. EoE’nin Th2 aracılı bir hastalık6 olduğunun erken anlaşılması, epitel bütünlüğünü bozarak IL-13’ün itici bir aracı olarak keşfedilmesine yol açmıştır 3,4,21,23. Epitel bütünlüğü üzerindeki sitokin aracılı etkilerin genetik yatkınlık yoluyla içsel bariyer bozukluğundan diseksiyonuna izin veren deneysel sistemler, EoE’deki immün hücreler ve epitel arasındaki karmaşık etkileşimi inceleme imkanı sağlar. İnsan özofagus organoidleri ve hava-sıvı arayüz (ALI) kültürleri, sitokin stimülasyonunun epitel bütünlüğü üzerindeki sonucunu analiz etmek için değerli araçlar olarak önerilmiştir5.

Yetişkin dokuya özgü kök hücre (ASC) türevi özofagus organoidlerinin üretilmesi için ilk protokol, 2009 yılında bağırsak organoidlerinin ilk yayınlanan raporlarından beş yıl sonra, ince bağırsağın epitel bölmesini özetleyen bağırsak Lgr5 + ASC’leri kullanılarak oluşturulmuştur24. DeWard ve ark. murin özofagus epitel hücrelerinden organoidlerin üretilmesine öncülük etti25. 2018’de Kasagi ve ark. ölümsüzleştirilmiş insan özofagus skuamöz epitel hücre hattı EPC2-hTERT ve birincil hasta kaynaklı hücrelerden insan özofagus organoidleri üretti26. Aynı yıl, Zhang ve ark. indüklenmiş pluripotent kök hücre (iPSC) türevi özofagus organoidlerini başarıyla üretti. Özofagus progenitör hücre (EPC) gelişimi için TGFβ ve kemik morfogenetik protein (BMP) inhibisyonunun önemini ve tabakalı skuamöz epitelin farklılaşmasında Notch sinyallemesinin kritik rolünü tanımladılar26,27. Trisno ve meslektaşları, Sox2’yi gelişimsel kaderi özofagus farklılaşmasına yönlendiren bir Wnt inhibitörü olarak tanımlayarak bu bulguları tamamladılar28. Protokollerin, ortam bileşiminin ve kültür koşullarının müteakip iyileştirmeleri, organoid oluşum oranını arttırdı ve kriyoprezervasyondan sonra organoidlerin alt kültürlenmesini ve geri kazanılmasını mümkün kıldı 26,29,30,31,32. Bu organoidler, sitokinlerle stimülasyondan sonra doku mimarisini ve potansiyel hedef genlerin ekspresyonunu incelemek için güçlü araçlar olmasına rağmen, özofagus organoidleri, bariyer bütünlüğü için doğrudan ölçümler olarak transepitelyal direnci (TEER) veya makromolekül akısını ölçme imkanı sunmayacaktır. Sherrill ve meslektaşları22 tarafından daha önce tanımlandığı gibi, epitelyal farklılaşmayımodelleyen ALI kültürleri 4, epitel bütünlüğünün doğrudan değerlendirilmesine izin verir. Hasta kaynaklı organoidleri ve ALI kültürlerini birleştirmek, EoE’de doku mimarisini ve epitel bariyer bütünlüğünü araştırmak için güçlü bir araçtır.

Burada, özofagus biyopsilerinden canlı hücrelerin izole edilmesi ve sitokinlerin bariyer bütünlüğü üzerindeki etkilerini incelemek için daha fazla kullanılabilecek özofagus organoid ve ALI kültürlerinin oluşturulması için talimatlar içeren prosedürler verilmiştir.

Protocol

Prosedürler Kuzeybatı ve Orta İsviçre etik komitesi (EKNZ; Proje Kimliği 2019-00273). Tüm hastalar endoskopik incelemeden önce biyopsilerin deneysel kullanımı için yazılı bilgilendirilmiş onam verdiler. Çalışmada kullanılan reaktifler ve ekipmanlar Malzeme Tablosunda listelenmiştir. 1. Hasta kaynaklı özofagus organoidleri için hücre izolasyonu NOT: İnsan özofagus organoidlerinin kültürlenmesi için ortam bile…

Representative Results

Özofagus organoidleri, ters çevrilmiş bir parlak alan mikroskobu ile belgelendiği gibi, sağlanan protokolün talimatlarına göre hasta biyopsilerinden ekstrakte edilen birincil hücrelerden büyüyecektir (Şekil 1). Epitelyal ASC’ler, izole edilen hücreleri bazal membran ekstraktında tohumladıktan sonra kültürün ilk iki günü içinde kendi kendini organize eden bir şekilde hücre kümeleri oluşturmaya başlar ve bir iskele görevi görür. Ters çevrilmiş parlak alan mikrosk…

Discussion

Sağlanan prosedürler, başarı olasılığı yüksek olan hasta kaynaklı organoidlerin ve ALI kültürlerinin yetiştirilmesine izin verir. Organoid protokolü, insan özofagus organoidlerinin26 oluşumunu bildiren ilk yayınlanan protokolden ve yakın zamanda yayınlanan bir protokolden32 uyarlanmıştır. Sherill ve meslektaşları ALI model22’yi tanımladılar. Organoidler ve ALI kültür modelleri, EoE 5,26<s…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

SNSF’nin J.H.N.’ye verdiği 310030_219210 no’lu hibe, bu el yazmasının herhangi bir kısıtlama olmaksızın yayınlanmasını destekledi. Şekil 1 , BioRender.com yardımıyla oluşturulmuştur.

Materials

1250 µL Griptip – Filter Integra 4445
300 µL Griptip – Filter Integra 4435
70 µM cell strainer Sarstedt 83.3945.070
Ascorbic Acid Sigma-Aldrich (Merck) A4544
Bovine pituitary extract Gibco (Thermo Fischer Scientific) 3700015
Calcium chloride Sigma-Aldrich (Merck) 21115
Cell Culture Multiwell Plates CELLSTAR for suspension cultures Greiner Bio-One 7.657 185
Cultrex Basement Membrane Extract (BME), Type 2, Pathclear R&D Systems (Bio-Techne) 3532-010-02
Dimethyl sulfoxide (DMSO), >99,5% BioScience Grade Carl Roth A994
Dispase I Corning 354235
Dispase II Sigma-Aldrich (Merck) D4693
Dulbeccos Phosphate Buffered Saline  (DPBS) Sigma-Aldrich (Merck) D8537
EVE Automated Cell Counter NanoEntek EVE-MC
EVE Cell counting slide NanoEntek EVS-050
Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap Falcon 352235
Fluorescin isothiocyanate (FITC)-dextran Sigma-Aldrich (Merck) FD4 average mol wt 3000-5000
Heraeus – Megafuge  40R  Thermo Fisher Scientific 75004518
Human recombinant epidermal growth factor Gibco (Thermo Fischer Scientific) 3700015
Keratinocyte-SFM Gibco (Thermo Fischer Scientific) 17005042
Penicillin-Streptomycin Gibco (Thermo Fischer Scientific) 15140122
Recombinant Human KGF/FGF-7 Protein R&D Systems (Bio-Techne) 251-KG-010/CF
Screw cap tube, 15 mL Sarstedt 62.554.502
Single Channel EVOLVE 100-1000 µL  Integra 3018
Single Channel EVOLVE 20-200 µL  Integra 3016
Syringe 1 mL 1134950
ThermoMixer C Eppendorf 5382000015
Trypsin inhibitor from Glycine max (soybean) Sigma-Aldrich (Merck) T9128
Trypsin-EDTA SAFC Biosciences (Merck) 59418C
Y27632 dihydrochloride Tocris (Bio-Techne) 1254

Referenzen

  1. Wu, L., et al. Filaggrin and tight junction proteins are crucial for IL-13-mediated esophageal barrier dysfunction. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 315 (3), G341-G350 (2018).
  2. Davis, B. P., et al. Eosinophilic esophagitis-linked calpain 14 is an IL-13-induced protease that mediates esophageal epithelial barrier impairment. JCI Insight. 1 (4), e86355 (2016).
  3. Blanchard, C., et al. Coordinate interaction between IL-13 and epithelial differentiation cluster genes in eosinophilic esophagitis. J Immunol. 184 (7), 4033-4041 (2010).
  4. Kc, K., Rothenberg, M. E., Sherrill, J. D. In vitro model for studying esophageal epithelial differentiation and allergic inflammatory responses identifies keratin involvement in eosinophilic esophagitis. PLoS One. 10 (6), e0127755 (2015).
  5. Kaymak, T., et al. IL-20 subfamily cytokines impair the oesophageal epithelial barrier by diminishing filaggrin in eosinophilic oesophagitis. Gut. 72 (5), 821-833 (2023).
  6. Straumann, A., Bauer, M., Fischer, B., Blaser, K., Simon, H. U. Idiopathic eosinophilic esophagitis is associated with a T(H)2-type allergic inflammatory response. J Allergy Clin Immunol. 108 (6), 954-961 (2001).
  7. Straumann, A., Spichtin, H. P., Bernoulli, R., Loosli, J., Vogtlin, J. Idiopathic eosinophilic esophagitis: a frequently overlooked disease with typical clinical aspects and discrete endoscopic findings. Schweiz Med Wochenschr. 124 (33), 1419-1429 (1994).
  8. Attwood, S. E., Smyrk, T. C., Demeester, T. R., Jones, J. B. Esophageal eosinophilia with dysphagia. A distinct clinicopathologic syndrome. Dig Dis Sci. 38 (1), 109-116 (1993).
  9. Kelly, K. J., et al. Eosinophilic esophagitis attributed to gastroesophageal reflux: improvement with an amino acid-based formula. Gastroenterology. 109 (5), 1503-1512 (1995).
  10. Fogg, M. I., Ruchelli, E., Spergel, J. M. Pollen and eosinophilic esophagitis. J Allergy Clin Immunol. 112 (4), 796-797 (2003).
  11. Wolf, W. A., Jerath, M. R., Dellon, E. S. De-novo onset of eosinophilic esophagitis after large volume allergen exposures. J Gastrointestin Liver Dis. 22 (2), 205-208 (2013).
  12. Moawad, F. J., et al. Correlation between eosinophilic oesophagitis and aeroallergens. Aliment Pharmacol Ther. 31 (4), 509-515 (2010).
  13. Woo, W., Aceves, S. S. The role of the allergist in the management of eosinophilic esophagitis. Curr Opin Gastroenterol. 37 (4), 390-396 (2021).
  14. Dellon, E. S., et al. Updated International Consensus diagnostic criteria for eosinophilic esophagitis: Proceedings of the AGREE conference. Gastroenterology. 155 (4), 1022-1033 (2018).
  15. Liacouras, C. A., Spergel, J., Gober, L. M. Eosinophilic esophagitis: Clinical presentation in children. Gastroenterol Clin North Am. 43 (2), 219-229 (2014).
  16. Sleiman, P. M., et al. GWAS identifies four novel eosinophilic esophagitis loci. Nat Commun. 5, 5593 (2014).
  17. Kottyan, L. C., et al. Genome-wide association analysis of eosinophilic esophagitis provides insight into the tissue specificity of this allergic disease. Nat Genet. 46 (8), 895-900 (2014).
  18. Kottyan, L. C., et al. Replication and meta-analyses nominate numerous eosinophilic esophagitis risk genes. J Allergy Clin Immunol. 147 (1), 255-266 (2021).
  19. Sherrill, J. D., et al. Analysis and expansion of the eosinophilic esophagitis transcriptome by RNA sequencing. Genes Immun. 15 (6), 361-369 (2014).
  20. Collins, M. H., et al. Newly developed and validated eosinophilic esophagitis histology scoring system and evidence that it outperforms peak eosinophil count for disease diagnosis and monitoring. Dis Esophagus. 30 (3), 1-8 (2017).
  21. Rochman, M., et al. Profound loss of esophageal tissue differentiation in patients with eosinophilic esophagitis. J Allergy Clin Immunol. 140 (3), 738-749 (2017).
  22. Sherrill, J. D., et al. Desmoglein-1 regulates esophageal epithelial barrier function and immune responses in eosinophilic esophagitis. Mucosal Immunol. 7 (3), 718-729 (2014).
  23. Blanchard, C., et al. IL-13 involvement in eosinophilic esophagitis: transcriptome analysis and reversibility with glucocorticoids. J Allergy Clin Immunol. 120 (6), 1292-1300 (2007).
  24. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  25. DeWard, A. D., Cramer, J., Lagasse, E. Cellular heterogeneity in the mouse esophagus implicates the presence of a nonquiescent epithelial stem cell population. Cell Rep. 9 (2), 701-711 (2014).
  26. Kasagi, Y., et al. The esophageal organoid system reveals functional interplay between Notch and cytokines in reactive epithelial changes. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 5 (3), 333-352 (2018).
  27. Zhang, Y., et al. 3D modeling of esophageal development using human PSC-derived basal progenitors reveals a critical role for notch signaling. Cell Stem Cell. 23 (4), 516-529 (2018).
  28. Trisno, S. L., et al. Esophageal organoids from human pluripotent stem cells delineate sox2 functions during esophageal specification. Cell Stem Cell. 23 (4), 501-515 (2018).
  29. Kijima, T., et al. Three-dimensional organoids reveal therapy resistance of esophageal and oropharyngeal squamous cell carcinoma cells. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 7 (1), 73-91 (2019).
  30. Karakasheva, T. A., et al. Generation and characterization of patient-derived head and neck, oral, and esophageal cancer organoids. Curr Protoc Stem Cell Biol. 53 (1), e109 (2020).
  31. Zheng, B., et al. A new murine esophageal organoid culture method and organoid-based model of esophageal squamous cell neoplasia. iScience. 24 (12), 103440 (2021).
  32. Nakagawa, H., et al. Modeling epithelial homeostasis and reactive epithelial changes in human and murine three-dimensional esophageal organoids. Curr Protoc Stem Cell Biol. 52 (1), e106 (2020).
  33. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett’s epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
  34. Boyce, S. T., Ham, R. G. Calcium-regulated differentiation of normal human epidermal keratinocytes in chemically defined clonal culture and serum-free serial culture. J Invest Dermatol. 81, 33-40 (1983).
  35. Bertolero, F., Kaighn, M. E., Gonda, M. A., Saffiotti, U. Mouse epidermal keratinocytes. Clonal proliferation and response to hormones and growth factors in serum-free medium. Exp Cell Res. 155 (1), 64-80 (1984).
  36. Bertolero, F., Kaighn, M. E., Camalier, R. F., Saffiotti, U. Effects of serum and serum-derived factors on growth and differentiation of mouse keratinocytes. In Vitro Cell Dev Biol. 22 (7), 423-428 (1986).
  37. Witkowski, T. A., et al. Y-27632 acts beyond ROCK inhibition to maintain epidermal stem-like cells in culture. J Cell Sci. 136 (17), (2023).
  38. Chapman, S., Liu, X., Meyers, C., Schlegel, R., McBride, A. A. Human keratinocytes are efficiently immortalized by a Rho kinase inhibitor. J Clin Invest. 120 (7), 2619-2626 (2010).
  39. Sasaki, M., et al. Lysyl oxidase regulates epithelial differentiation and barrier integrity in eosinophilic esophagitis. bioRxiv. , (2023).
  40. Doyle, A. D., et al. Detergent exposure induces epithelial barrier dysfunction and eosinophilic inflammation in the esophagus. Allergy. 78 (1), 192-201 (2023).
  41. Hara, T., et al. CD73(+) epithelial progenitor cells that contribute to homeostasis and renewal are depleted in eosinophilic esophagitis. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 13 (5), 1449-1467 (2022).
  42. Kasagi, Y., et al. Fibrostenotic eosinophilic esophagitis might reflect epithelial lysyl oxidase induction by fibroblast-derived TNF-alpha. J Allergy Clin Immunol. 144 (1), 171-182 (2019).
  43. Spence, J. R., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro. Nature. 470 (7332), 105-109 (2011).
  44. Takebe, T., et al. Vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant. Nature. 499 (7459), 481-484 (2013).
  45. Bhatia, S. N., Ingber, D. E. Microfluidic organs-on-chips. Nat Biotechnol. 32 (8), 760-772 (2014).
  46. Nikolaev, M., et al. Homeostatic mini-intestines through scaffold-guided organoid morphogenesis. Nature. 585 (7826), 574-578 (2020).
  47. Schutgens, F., et al. Tubuloids derived from human adult kidney and urine for personalized disease modeling. Nat Biotechnol. 37 (3), 303-313 (2019).
  48. Sorrentino, G., et al. Mechano-modulatory synthetic niches for liver organoid derivation. Nat Commun. 11 (1), 3416 (2020).
  49. Azouz, N. P., et al. The antiprotease SPINK7 serves as an inhibitory checkpoint for esophageal epithelial inflammatory responses. Sci Transl Med. 10 (444), 9736 (2018).
  50. Azouz, N. P., et al. Functional role of kallikrein 5 and proteinase-activated receptor 2 in eosinophilic esophagitis. Sci Transl Med. 12 (545), 7773 (2020).

Play Video

Diesen Artikel zitieren
Kaymak, T., Niess, J. H. Three-Dimensional Cell Culture Models to Investigate the Epithelial Barrier in Eosinophilic Esophagitis . J. Vis. Exp. (207), e66503, doi:10.3791/66503 (2024).

View Video