호산구성 식도염의 상피 장벽을 조사하기 위한 3차원 세포 배양 모델
Summary
여기에서는 인간 식도 오가노이드 배양 및 공기-액체 계면 배양을 위한 프로토콜을 제공합니다. 식도 오가노이드의 공기-액체 계면 배양은 식도 상피 장벽에 대한 사이토카인의 영향을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.
Abstract
식도의 편평 상피는 환경에 직접 노출되어 식품 항원 및 미생물을 포함한 외부 항원과 지속적으로 마주합니다. 상피 장벽의 무결성을 유지하는 것은 감염을 예방하고 무해한 식품 유래 항원으로 인한 염증을 피하는 데 매우 중요합니다. 이 기사에서는 조직 항상성 및 질병의 맥락에서 식도의 상피 구획을 연구하기 위해 환자 생검에서 인간 식도 오가노이드 및 공기-액체 계면 배양을 생성하기 위한 간소화된 프로토콜을 제공합니다. 이러한 프로토콜은 지난 10년 동안 중요한 과학적 이정표였으며, 환자 유래 일차 세포, 오가노이드 및 공기-액체 계면 배양에서 3차원 장기와 같은 구조를 설명했습니다. 그들은 3차원 프레임워크 내에서 식도 상피의 특정 사이토카인, 성장 인자 및 신호 경로의 기능을 조사하면서 기증자의 표현형 및 유전적 특성을 유지할 수 있는 가능성을 제공합니다. 오가노이드는 사이토카인 자극 후 전사체와 단백질체를 평가하여 조직 미세구조에 대한 정보를 제공합니다. 대조적으로, 공기-액체 계면 배양은 경상피 저항성(TEER) 또는 거대분자 플럭스 측정을 통해 상피 장벽 무결성을 평가할 수 있습니다. 이러한 오가노이드와 공기-액체 계면 배양을 결합하는 것은 손상된 식도 상피 장벽 상태에 대한 연구를 발전시키는 강력한 도구입니다.
Introduction
식도 염증은 Th2 지배 만성 식도 염증성 질환인 호산구성 식도염(EoE)에서 관찰되는 바와 같이 상피 장벽 무결성 1,2,3,4,5를 손상시킨다 6. EoE는 1990년대에 처음 기술되었으며7,8 주로 식품 항원 9,10,11,12,13에 의해 유도됩니다. 성인 인구에서 가장 빈번하게 발생하는 EoE 증상은 삼킴곤란과 음식물 매립이다14. 소아의 경우, EoE는 전형적으로 성장 부진, 음식 거부, 구토, 복통 등으로 나타난다15. 게놈 전체 연관 연구(Genome-wide association studies, GWAS)는 상피 장벽 무결성에 관여하는 EoE 위험 유전자를 식별하여 상피를 EoE 연구의 초점으로 이동시켰습니다 16,17,18. EoE 전사체학은 또한 손상된 분화 과정과 반응성 기저 영역 증식이 식도 상피 3,5,19,20,21,22의 손상된 장벽 기능을 유발한다는 것을 밝혔습니다. EoE가 Th2매개 질환이라는 초기의 이해6는 상피 무결성 3,4,21,23을 방해함으로써 IL-13을 구동 매개체로 발견하게 되었습니다. 유전적 소인을 통한 내인적 장벽 손상에서 상피 무결성에 대한 사이토카인 매개 효과를 해부할 수 있는 실험 시스템은 EoE에서 면역 세포와 상피 사이의 복잡한 상호 작용을 연구할 수 있는 가능성을 제공합니다. 인간 식도 오가노이드 및 공기-액체 계면(ALI) 배양은 사이토카인 자극이 상피 무결성에 미치는 영향을 분석하기 위한 유용한 도구로 제안되었습니다5.
성체 조직 특이적 줄기세포(ASC) 유래 식도 오가노이드를 생성하기 위한 첫 번째 프로토콜은 2009년 소장의 상피 구획을 재현하는 장 Lgr5+ ASC를 사용하여 장 오가노이드에 대한 첫 번째 발표된 보고서 이후 5년 후에 확립되었습니다24. DeWard et al.은 쥐 식도 상피 세포에서 오가노이드를 생성하는 데 앞장섰습니다25. 2018년, Kasagi et al.은 불멸화된 인간 식도 편평 상피 세포주 EPC2-hTERT 및 1차 환자 유래 세포26에서 인간 식도 오가노이드를 생성했습니다. 같은 해에 Zhang 등은 유도만능줄기세포(iPSC) 유래 식도 오가노이드를 성공적으로 생성했습니다. 그들은 식도 전구 세포(EPC) 발달에 대한 TGFβ 및 뼈 형태 형성 단백질(BMP) 억제의 중요성과 층화 편평 상피26,27의 분화에서 Notch 신호의 중요한 역할을 설명했습니다. 트리스노(Trisno)와 동료들은 Sox2를 식도 분화(esophageal differentiation)로 발달 운명을 이끄는 Wnt 억제제(inhibitor)로 확인함으로써 이러한 발견을 보완했다28. 프로토콜, 배지 조성 및 배양 조건의 후속 개선으로 오가노이드 형성 속도가 증가하고 동결 보존 후 오가노이드를 하위 배양 및 회수할 수 있게 되었습니다 26,29,30,31,32. 이러한 오가노이드는 사이토카인으로 자극한 후 조직 구조와 잠재적 표적 유전자의 발현을 연구하기 위한 강력한 도구이지만, 식도 오가노이드는 장벽 무결성에 대한 직접적인 측정으로 경상피 저항성(TEER) 또는 거대분자 플럭스를 측정할 수 있는 가능성을 제공하지 않습니다. Sherrill과 동료들에 의해 이전에 기술된바와 같이22, 상피 분화(epithelial differentiation)4를 모델링하는 ALI 배양은 상피 무결성(epithelial integrity)에 대한 직접적인 평가를 가능하게 한다. 환자 유래 오가노이드와 ALI 배양을 결합하는 것은 EoE에서 조직 구조와 상피 장벽 무결성을 조사하기 위한 강력한 도구입니다.
다음은 식도 생검에서 생존 가능한 세포를 분리하고 사이토카인이 장벽 무결성에 미치는 영향을 추가로 연구하는 데 사용할 수 있는 식도 오가노이드 및 ALI 배양을 확립하기 위한 지침이 포함된 절차입니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
제공된 절차를 통해 성공 가능성이 높은 환자 유래 오가노이드 및 ALI 배양을 할 수 있습니다. 오가노이드 프로토콜은 인간 식도 오가노이드26의 생성을 보고하는 첫 번째 발표된 프로토콜과 최근에 발표된 프로토콜32에서 채택되었습니다. Sherill과 동료들은 ALI 모델22를 설명했습니다. 오가노이드 및 ALI 배양 모델은 EoE 5,26<…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
SNSF가 J.H.N.에 부여한 보조금 310030_219210은 이 원고의 출판을 제한 없이 지원했다. 그림 1 은 BioRender.com 의 도움으로 만들어졌습니다.
Materials
| 1250 µL Griptip – Filter | Integra | 4445 | |
| 300 µL Griptip – Filter | Integra | 4435 | |
| 70 µM cell strainer | Sarstedt | 83.3945.070 | |
| Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich (Merck) | A4544 | |
| Bovine pituitary extract | Gibco (Thermo Fischer Scientific) | 3700015 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich (Merck) | 21115 | |
| Cell Culture Multiwell Plates CELLSTAR for suspension cultures | Greiner Bio-One | 7.657 185 | |
| Cultrex Basement Membrane Extract (BME), Type 2, Pathclear | R&D Systems (Bio-Techne) | 3532-010-02 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO), >99,5% BioScience Grade | Carl Roth | A994 | |
| Dispase I | Corning | 354235 | |
| Dispase II | Sigma-Aldrich (Merck) | D4693 | |
| Dulbeccos Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Sigma-Aldrich (Merck) | D8537 | |
| EVE Automated Cell Counter | NanoEntek | EVE-MC | |
| EVE Cell counting slide | NanoEntek | EVS-050 | |
| Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap | Falcon | 352235 | |
| Fluorescin isothiocyanate (FITC)-dextran | Sigma-Aldrich (Merck) | FD4 | average mol wt 3000-5000 |
| Heraeus – Megafuge 40R | Thermo Fisher Scientific | 75004518 | |
| Human recombinant epidermal growth factor | Gibco (Thermo Fischer Scientific) | 3700015 | |
| Keratinocyte-SFM | Gibco (Thermo Fischer Scientific) | 17005042 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco (Thermo Fischer Scientific) | 15140122 | |
| Recombinant Human KGF/FGF-7 Protein | R&D Systems (Bio-Techne) | 251-KG-010/CF | |
| Screw cap tube, 15 mL | Sarstedt | 62.554.502 | |
| Single Channel EVOLVE 100-1000 µL | Integra | 3018 | |
| Single Channel EVOLVE 20-200 µL | Integra | 3016 | |
| Syringe 1 mL | 1134950 | ||
| ThermoMixer C | Eppendorf | 5382000015 | |
| Trypsin inhibitor from Glycine max (soybean) | Sigma-Aldrich (Merck) | T9128 | |
| Trypsin-EDTA | SAFC Biosciences (Merck) | 59418C | |
| Y27632 dihydrochloride | Tocris (Bio-Techne) | 1254 |
Referenzen
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