여기에서는 그래핀의 단일 단층을 전자 현미경 그리드에 적용하기 위한 프로토콜과 CryoEM 구조 결정에 사용하기 위해 이를 준비하는 방법에 대해 설명합니다.
극저온 전자 현미경(cryoEM)은 고분자 복합체의 원자 구조를 조사하기 위한 강력한 기술로 부상했습니다. CryoEM을 위한 시료 전처리는 일반적으로 천공된 지지 필름의 구멍 내에 부유하는 유리질 얼음의 얇은 층에 검체를 보존해야 합니다. 그러나 CryoEM 연구에 일반적으로 사용되는 모든 시료 전처리 접근법은 시편을 공기-물 계면에 노출시켜 시료에 강한 소수성 효과를 발생시켜 종종 변성, 응집 및 복잡한 해리를 초래합니다. 또한, 시료의 영역과 공기-물 계면 사이의 바람직한 소수성 상호 작용은 거대분자가 채택한 방향에 영향을 미쳐 이방성 방향 분해능으로 3D 재구성을 가능하게 합니다.
CryoEM 표본을 그래핀 단층에 흡착하면 배경 노이즈의 유입을 최소화하면서 공기-물 계면과의 상호 작용을 완화하는 데 도움이 되는 것으로 나타났습니다. 그래핀 지지체는 또한 CryoEM 이미징에 필요한 단백질 농도를 크게 낮추는 이점을 제공합니다. 이러한 지지대의 장점에도 불구하고 그래핀 코팅 그리드는 상업적 옵션의 엄청난 비용과 대규모 자체 생산과 관련된 문제로 인해 CryoEM 커뮤니티에서 널리 사용되지 않습니다. 이 논문은 단층 그래핀을 거의 완전히 커버하는 CryoEM 그리드 배치를 준비하는 효율적인 방법을 설명합니다.
단일 입자 극저온 전자 현미경(cryoEM)은 생체 고분자의 3D 구조를 조사하는 데 점점 더 많이 사용되는 기술입니다. 지난 10년 동안 전자 현미경 광학, 직접전자 검출1 및 컴퓨터 알고리즘 2,3,4의 기술 발전으로 CryoEM 사용자는 거의 원자 분해능 5,6,7,8 까지 생화학적으로 안정적인 고분자 복합체의 구조를 결정할 수 있게 되었습니다 . 이러한 발전에도 불구하고 CryoEM 이미징을 위한 시료 보존에는 여전히 중요한 장벽이 남아 있으며, 이로 인해 대부분의 생물학적 시료가 고해상도로 분해되지 않습니다.
고분해능 CryoEM 분석을 위한 시료 전처리에는 유리화된 얼음의 얇은 층 내에 광범위한 방향으로 고르게 분포된 거대분자를 포획하는 작업이 포함됩니다. “블롯 및 플런지” 동결 방법은 CryoEM 연구를 위해 그리드에서 생물학적 샘플의 박막을 생성하는 데 가장 널리 사용되는 방법입니다 9,10. 이러한 방법은 친수성으로 만들어진 창공 필름이 포함된 EM 그리드에 몇 마이크로리터의 샘플 용액을 적용한 다음 여과지로 샘플의 대부분을 제거한 다음 그리드를 액체 에탄 또는 에탄-프로판 혼합물의 극저온제에 빠르게 담그는 것을 포함합니다9.
이 방법은 광범위한 생물학적 표본의 구조를 측정하는 데 성공적으로 사용되었지만, 일반적으로 사용되는 모든 CryoEM 표본 준비 방법은 표본을 소수성 공기-물 계면(AWI)에 노출시키므로 고해상도 구조 측정을 제한하는 문제가 발생하는 경우가 많습니다. 생물학적 표본은 AWI에 노출될 때 변성되는 경향이 높으며, 이는 복잡한 응집 및 분해로 이어질 수 있음이 확인되었습니다11,12,13,14. 더욱이, 생물학적 표본의 표면 상의 소수성 패치는 입자가 얼음(12)에서 바람직한 방향을 채택하도록 한다. 많은 시나리오에서 샘플의 단일 소수성 영역은 모든 입자가 얼음에서 단일 방향을 채택하도록 강제하므로 신뢰할 수 있는 재구성을 생성하는 능력이 없어집니다. AWI의 문제점에 더하여, 시편은 구멍(15) 내의 얼음 내에 부유하는 입자의 수를 제한하는 필름의 창호층의 표면에 대한 친화력을 나타낼 수 있다.
AWI 또는 필름과의 상호 작용에서 발생하는 이러한 문제를 줄이기 위해 몇 가지 방법론적, 기술적 솔루션이 개발되었습니다16,17. 한 가지 인기 있는 접근 방식은 EM 그리드의 창공 필름을 비정질 탄소의 얇은(수십 나노미터) 층으로 코팅하는 것입니다. 이 코팅은 입자가 흡착될 수 있는 구멍에 연속적인 표면을 제공하여 AWI15,18,19,20과의 상호 작용으로부터 시료를 부분적으로 보호하는 이점이 있습니다. 그러나 추가 탄소 층은 이미징된 영역에서 배경 신호의 양을 증가시켜 특히 작은(<150kDa) 표본의 경우 달성 가능한 분해능을 손상시킬 수 있는 노이즈를 유발합니다. 최근 몇 년 동안 산화그래핀(GO) 플레이크를 사용하여 CryoEM 그리드에서 지지 필름을 생산하는 것이 기존의 비정질 탄소에 비해 장점이 있는 것으로 나타났습니다. GO 플레이크는 흑연 층의 산화를 통해 생성되며, 표면과 가장자리에 카르복실, 수산기 및 에폭시기 형태의 상당한 산소 함량으로 인해 친수성인 단층 흑연의 유사 결정질 시트가 생성됩니다. 수성 현탁액 내의 상용 GO 플레이크는 저렴하며, GO 플레이크를 EM 그리드에 적용하기 위한 수많은 공개된 방법이 있다(18,21). 그러나 이러한 방법은 종종 GO 플레이크로 부분적으로만 덮인 그리드와 여러 층의 GO 플레이크를 포함하는 영역을 생성합니다. 또한 GO 플레이크는 얇은 비정질 탄소22,23에서 관찰된 것과 유사한 CryoEM 이미지에 눈에 띄는 배경 신호를 제공합니다.
탄소 원자의 단일 2D 결정 배열로 구성된 자연 그대로의 단층 그래핀은 전자 현미경에서 위상차를 생성하지 않는다는 점에서 GO와 구별됩니다. 따라서 단층 그래핀은 생물학적 샘플을 이미징하기 위한 보이지 않는 지지층을 생성하는 데 사용할 수 있습니다. 단층 그래핀은 또한 GO보다 강하고 EM 그리드에 단일 단층으로 적용될 수 있으며, 최근 그래핀 코팅된 EM 그리드 제조의 발전으로 고커버리지 단층 그래핀 그리드를 사내에서 제조할 수 있게 되었습니다 24,25,26,27,28,29,30. 그러나 CryoEM 구조 측정에 그래핀 코팅 그리드를 사용할 때의 이점에도 불구하고 상업적 옵션의 엄청난 비용과 자체 생산의 복잡성으로 인해 널리 사용되지 않습니다. 여기에서는 생물학적 표본의 CryoEM 구조 측정을 위해 그래핀 단층으로 덮인 EM 그리드를 효과적으로 생성하기 위한 단계별 가이드를 설명합니다(그림 1). 이 상세한 프로토콜을 따름으로써 CryoEM 연구원은 하루에 수십 개의 고품질 그래핀 지지 그리드를 재현성 있게 준비할 수 있습니다. 그래핀 코팅 그리드의 품질은 LaB6 필라멘트가 장착된 저가형 투과 전자 현미경(TEM)을 사용하여 쉽게 검사할 수 있습니다.
유리질 얼음의 얇은 층에서 생물학적 시료를 보존하는 것은 고분해능 CryoEM 구조 측정에 매우 중요한 단계입니다. 그러나 연구자들은 AWI와의 상호 작용으로 인해 발생하는 문제에 자주 직면하는데, 이는 선호 방향, 복잡한 분해, 변성 및 응집을 유발합니다. 더욱이, 샘플은 창호 필름의 구멍에 매달려 있는 얇은 얼음을 채울 수 있을 만큼 항상 충분히 농축될 수 없습니다. 여러 연구 그룹은 이러한 한계 24,25,26,27,28,29,30 중 일부를 극복하는 데 도움이 되도록 그래핀의 단층으로 EM 그리드를 코팅하는 방법을 개발했으며 그래핀 그리드는 큰 성공을 거두었습니다. 여기에서는 사내에서 그래핀 그리드 배치를 효과적으로 준비하고 TEM으로 그래핀 그리드의 품질을 검사하기 위한 단계별 지침을 제공합니다. 우리는 아래에 요약된 몇 가지 중요한 단계에서 특별한 주의를 기울여야 함을 강조합니다.
그래핀은 공기 중 오염 물질을 끌어들이는 경향이 강합니다. 따라서 그래핀 그리드 제조 과정에서 그래핀/Cu 시트 또는 그리드와 접촉하는 모든 도구가 깨끗하고 먼지가 없는지 확인하는 것이 중요합니다. 그래핀을 옮기는 데 사용되는 유리 커버슬립은 에탄올과 탈이온수로 헹구거나 에어 더스터를 사용하여 청소할 수 있습니다. 또한 흄 후드 아래에서 작업하고 그래핀 시트와 그리드를 항상 호일이나 깨끗한 유리판으로 덮은 상태로 유지하는 것이 좋습니다. 그리드의 먼지나 오염 물질은 그래핀이 EM 그리드에 완전히 부착되는 것을 방해할 수 있습니다. 그래핀 또는 그래핀 코팅 그리드를 취급할 때는 정전기 방전으로 인한 그래핀 필름의 손상을 방지하기 위해 전기적으로 접지하는 것이 중요합니다. 정전기 방전은 손목 접지 스트랩을 사용하거나, 그래핀 또는 그래핀 그리드를 취급할 때마다 접지된 금속 물체를 만지거나, 및/또는 핀셋(24)을 잡는 손에 장갑을 착용하지 않음으로써 피할 수 있다.
그래핀의 단층은 매우 얇기 때문에(탄소 원자의 너비) 그래핀을 그리드로 옮기는 동안 MMA 또는 폴리-MMA(PMMA)와 같은 유기층으로 그래핀을 지지하는 것이 중요합니다. PMMA는 그래핀 전달에 가장 널리 사용되는 재료입니다. 그러나 PMMA는 그래핀과 강한 친화력을 가지며 종종 그래핀 필름에 폴리머 오염을 초래할 수 있습니다. MMA는 잔류 오염을 덜 남기기 때문에 이 프로토콜에서 사용된다25. 그러나 PMMA와 MMA는 모두 그래핀 필름의 일부 영역에서 관찰할 수 있는 주름과 균열을 형성하는 단점이 있습니다(그림 3B). 이러한 주름을 피하는 것은 CVD 방법(31)에 의해 그래핀 성장 동안 일반적으로 발생하기 때문에 어려울 수 있다. 주름 없이 울트라 플랫 그래핀을 성장시키기 위한 방법이 최근에 개발되었는데, 이에 의해 동박은 성장 기질(32)로서 Cu(111)/사파이어 웨이퍼로 대체된다.
당사의 경험에 비추어 볼 때, 구리 에칭 후 부서지기 쉽고 후속 단계에서 다루기 어려운 고분자로 덮인 Cu-그래핀 시트를 제조업체에서 구입하는 것보다 그래핀/Cu 시트를 사내에서 구매하여 MMA로 그래핀을 지지하는 것이 좋습니다. MMA 코팅에 사용한 스핀 코터는 앞서 설명한 대로 로컬 컴퓨터/철물점의 부품을 사용하여 저렴하게 제작할 수 있습니다25.
MMA 코팅 단계에서, Cu-graphene 시트의 그래핀 표면 전체를 MMA로 덮는 것이 중요하다. Cu가 에칭된 후 MMA-그래핀은 반투명해지고 MMA 커버리지가 없는 영역은 빈 구멍처럼 보입니다. 구리 쪽의 MMA 코팅을 방지하려면 코팅하는 동안 CVD 필름에서 회전하는 과도한 MMA를 흡수하도록 그 아래에 작은 압지를 놓는 것이 중요합니다.
에칭 및 헹굼 후 MMA/그래핀 시트는 수위를 제어하기 위해 주사기 또는 연동 펌프가 있는 상업용 또는 수제 트로프 시스템을 사용하여 EM 그리드로 옮길 준비가 됩니다. 이송 단계 전에 클로로포름, 아세톤 및 IPA의 연속 수조에서 그리드를 철저히 헹구는 것이 중요합니다. 그래핀 코팅된 그리드를 65°C에서 베이킹하면 그래핀 무결성을 보존하고 그래핀이 그리드에 흡착되는 것을 촉진합니다. 마지막으로, 그리드의 MMA 오염을 방지하려면 아세톤 수조에서 MMA를 완전히 제거하고 IPA에서 그리드를 청소하는 것이 중요합니다. 세척되지 않은 MMA 잔류물은 EM 그리드에서 관찰되어 이미지의 신호 대 잡음비를 감소시킵니다(그림 3C). 아세톤-IPA 세척 공정을 반복하여 그래핀 표면을 추가로 청소할 수 있습니다.
그래핀 그리드를 친수성으로 렌더링하기 위해 그리드를 UV/오존에 노출시켰습니다. UV/오존 클리너의 다양한 모델은 그래핀을 손상시키지 않고 CryoEM 시료 전처리를 위해 그래핀 층에 충분한 산소를 공급하기 위해 최적화가 필요할 수 있습니다. 시스템에 관계없이 UV/오존 처리 직후 CryoEM 시료 응용 분야에 이러한 그리드를 사용하는 것이 중요합니다. 그래핀 그리드를 친수성으로 렌더링하는 대안적인 방법은 다른 연구들(33,34)에 기술되어 있다.
The authors have nothing to disclose.
Scripps Research에서 이러한 방법을 확립하는 동안 유용한 토론을 해주신 Xiao Fan 박사님께 감사드립니다. B.B.는 Hewitt Foundation for Medical Research의 박사 후 연구 펠로우십의 지원을 받았습니다. WC는 국립 과학 재단 박사 전 펠로우십의 지원을 받습니다. D.E.P는 미국 국립보건원(NIH)의 보조금 NS095892 G.C.L.의 지원을 받습니다. 이 프로젝트는 또한 NIH 보조금 GM142196, GM143805 및 S10OD032467 G.C.L.의 지원을 받았습니다.
70% EtOH | Pharmco (190 pf EtOH) | 241000190CSGL | |
Acetone | Sigma Aldrich | 650501-4L | |
Ammonium persulfate (APS) | Sigma Aldrich | 215589-500g | Hazardous; use extreme caution |
Chloroform | Sigma Aldrich | C2432-1L | |
Clamping TEM Grid Holder Block for 45 Grids | PELCO | 16830-45 | |
Computer fan | Amazon (Noctua) | B07CG2PGY6 | |
Cover slip | Bellco Glass | 1203J71 | Standard cover slips |
Crystallizing dish | Pyrex | 3140-100 | |
Electronics duster | Falcon Safety Products | 75-37-6 | |
Falcon Dust-off Air Duster | Staples | N/A | |
Filter papers | Whatman | 1001-055 | |
Fine tip tweezer | Dumont | 0508-L4-PO | |
Flask | Pyrex | 4980-500 | |
Fork | Supermarket | N/A | |
Glass pasteur pipette | VWR | 14672-608 | |
Graphene/Cu | Graphenea | N/A | CVD monolayer graphene cu |
Grid Coating Trough | Ladd Research Industries | 10840 | Fragile |
Isopropanol | Fisher Scientific | 67-63-0 | |
Kapton Tape | Amazon (MYJOR) | MY-RZY001 | Polyimide tape |
Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666 | |
Long twzeer | Cole Parmer Essentials | UX-07387-15 | |
Metal grid holder | Ted Pella | 16820-81 | |
MMA(8.5)MMA EL 6 | KAYAKU Advanced Materials | M31006 0500L 1GL | Flammable |
Model 10 Lab Oven | Quincy Lab, Inc. | FO19013 | |
Petri dish | Pyrex | 3610-102 | |
Plasma cleaner (Solarus 950) | Gatan, Inc. | N/A | |
Scissors | Fiskars | 194813-1010 | |
Standard Analog Orbital Shaker | VWR | 89032-088 | |
UltrAuFoil R1.2/1.3 – Au300 | Quantifoil | N/A | Holey gold grids |
Ultraviolet Ozone Cleaning Systems | UVOCS | model T10X10/OES |