JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Ergebnisse
Discussion
Offenlegungen
Acknowledgements
Materials
Referenzen
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biologie

Fabricage van monolayer grafeen-gecoate roosters voor cryo-elektronenmicroscopie

Published: September 08, 2023
doi:
10.3791/65702
, , ,
1Department of Structural and Computational Biology,Scripps Research

Summary

Hier beschrijven we een protocol voor het aanbrengen van een enkele monolaag grafeen op elektronenmicroscopieroosters en hoe deze voor te bereiden op gebruik bij cryoEM-structuurbepaling.

Abstract

Cryogene elektronenmicroscopie (cryoEM) is naar voren gekomen als een krachtige techniek om de atomaire structuur van macromoleculaire complexen te onderzoeken. Monstervoorbereiding voor cryoEM vereist het bewaren van monsters in een dunne laag glasachtig ijs, meestal gesuspendeerd in de gaten van een gefenestreerde steunfilm. Alle veelgebruikte benaderingen voor monstervoorbereiding voor cryoEM-onderzoeken stellen het monster echter bloot aan het lucht-watergrensvlak, waardoor een sterk hydrofoob effect op het monster wordt geïntroduceerd dat vaak resulteert in denaturatie, aggregatie en complexe dissociatie. Verder beïnvloeden geprefereerde hydrofobe interacties tussen regio’s van het monster en de lucht-waterinterface de oriëntaties van de macromoleculen, wat resulteert in 3D-reconstructies met anisotrope directionele resolutie.

Het is aangetoond dat adsorptie van cryoEM-monsters op een monolaag grafeen helpt de interacties met het lucht-watergrensvlak te verminderen en tegelijkertijd de introductie van achtergrondgeluid te minimaliseren. Grafeenondersteuningen bieden ook het voordeel dat ze de vereiste concentratie van eiwitten die nodig zijn voor cryoEM-beeldvorming aanzienlijk verlagen. Ondanks de voordelen van deze ondersteuningen, worden met grafeen gecoate roosters niet veel gebruikt door de cryoEM-gemeenschap vanwege de onbetaalbare kosten van commerciële opties en de uitdagingen die gepaard gaan met grootschalige in-house productie. Dit artikel beschrijft een efficiënte methode voor het bereiden van batches cryoEM-roosters die bijna volledig bedekt zijn met monolaag grafeen.

Introduction

Single-particle cryogenic electron microscopy (cryoEM) is een steeds meer toepasbare technologie die wordt gebruikt om de 3D-structuren van biomacromoleculen te onderzoeken. Technologische vooruitgang op het gebied van elektronenmicroscoopoptica, directe elektronendetectie1 en computeralgoritmen 2,3,4 in het afgelopen decennium hebben cryoEM-gebruikers in staat gesteld de structuren van biochemisch stabiele macromoleculaire complexen te bepalen tot een bijna atomaire resolutie 5,6,7,8 . Ondanks deze vooruitgang blijven er opmerkelijke barrières bestaan voor het bewaren van monsters voor cryoEM-beeldvorming, waardoor de meerderheid van de biologische monsters niet met zulke hoge resoluties kan worden opgelost.

Monstervoorbereiding voor cryoEM-analyse met hoge resolutie omvat het vangen van macromoleculen die gelijkmatig verdeeld zijn in een breed scala aan oriëntaties in een dunne laag verglaasd ijs. De “blot and plunge”-methoden voor invriezen zijn de meest gebruikte methoden die worden gebruikt om dunne films van biologische monsters op roosters te genereren voor cryoEM-onderzoeken 9,10. Deze methoden omvatten het aanbrengen van een paar microliter monsteroplossing op een EM-rooster met een gefenestreerde film die hydrofiel is gemaakt en vervolgens het grootste deel van het monster wegvegen met filtreerpapier voordat het rooster snel in een cryogeen van vloeibaar ethaan of ethaan-propaanmengsel wordt gedompeld9.

Hoewel deze methode met succes is gebruikt om structuren van een breed scala aan biologische monsters te bepalen, stellen alle veelgebruikte cryoEM-monstervoorbereidingsmethoden monsters bloot aan de hydrofobe lucht-waterinterface (AWI), wat vaak problemen met zich meebrengt die de structuurbepaling met hoge resolutie beperken. Het is vastgesteld dat biologische monsters een hoge neiging hebben om te denatureren wanneer ze worden blootgesteld aan de AWI, wat kan leiden tot complexe aggregatie en demontage11,12,13,14. Bovendien zorgen hydrofobe vlekken op het oppervlak van biologische monsters ervoor dat deeltjes hun voorkeursoriëntaties in het ijs aannemen12. In veel scenario’s dwingt een enkel hydrofoob gebied van het monster alle deeltjes om een enkelvoudige oriëntatie in het ijs aan te nemen, waardoor het vermogen om een betrouwbare reconstructie te genereren wordt opgeheven. Naast problemen met de AWI, kunnen monsters een affiniteit vertonen voor het oppervlak van de gefenestreerde filmlaag, waardoor het aantal deeltjes dat in het ijs in de gaten is gesuspendeerd, wordt beperkt15.

Er zijn verschillende methodologische en technologische oplossingen ontwikkeld om deze problemen die voortvloeien uit interacties met het AWI of de filmste verminderen 16,17. Een populaire aanpak is om de gefenestreerde film van de EM-roosters te coaten met een dunne (tientallen nanometers) laag amorfe koolstof. Deze coating zorgt voor een doorlopend oppervlak over de gaten waaraan deeltjes kunnen adsorberen, met als voordeel dat het monster gedeeltelijk wordt afgeschermd van interacties met de AWI15,18,19,20. De extra koolstoflaag verhoogt echter de hoeveelheid achtergrondsignaal in de afgebeelde gebieden, waardoor ruis ontstaat die de haalbare resolutie in gevaar kan brengen, met name voor kleine (<150 kDa) exemplaren. In de afgelopen jaren is aangetoond dat het gebruik van grafeenoxide (GO)-vlokken om ondersteunende films op cryoEM-roosters te produceren, voordelen heeft ten opzichte van traditionele amorfe koolstof. GO-vlokken worden geproduceerd door de oxidatie van grafietlagen, wat resulteert in pseudo-kristallijne vellen van monolaags grafiet die hydrofiel zijn vanwege hun substantiële zuurstofgehalte in de vorm van carboxyl-, hydroxyl- en epoxygroepen op de oppervlakken en randen. Commerciële GO-vlokken in waterige suspensies zijn niet duur en er zijn tal van gepubliceerde methoden voor het aanbrengen van GO-vlokken op EM-roosters18,21. Deze methoden resulteren echter vaak in roosters die slechts gedeeltelijk bedekt zijn met GO-vlokken, evenals regio’s die meerdere lagen GO-vlokken bevatten. Verder dragen GO-vlokken een merkbaar achtergrondsignaal bij aan cryoEM-beelden dat dicht in de buurt komt van het signaal dat wordt waargenomen met dunne amorfe koolstof22,23.

Ongerept monolaaggrafeen, dat bestaat uit een enkele 2D-kristallijne reeks koolstofatomen, onderscheidt zich van GO doordat het geen fasecontrast produceert in de elektronenmicroscoop. Monolayer grafeen kan dus worden gebruikt om een onzichtbare ondersteuningslaag te genereren voor het in beeld brengen van biologische monsters. Monolaag grafeen is ook sterker dan GO en kan worden aangebracht als een enkele monolaag op een EM-raster, en recente ontwikkelingen in de fabricage van met grafeen gecoate EM-rasters hebben het mogelijk gemaakt om monolaagse grafeenroosters met een hoge dekking in eigen huis te bereiden 24,25,26,27,28,29,30. Ondanks de voordelen van het gebruik van met grafeen gecoate roosters voor het bepalen van de cryoEM-structuur, worden ze echter niet veel gebruikt vanwege de onbetaalbare kosten van commerciële opties en de complexiteit van interne productie. Hier beschrijven we een stap-voor-stap handleiding voor het effectief produceren van EM-roosters bedekt met een monolaag grafeen voor cryoEM-structuurbepaling van biologische monsters (Figuur 1). Door dit gedetailleerde protocol te volgen, kunnen cryoEM-onderzoekers op één dag tientallen hoogwaardige grafeen-ondersteuningsroosters reproduceerbaar voorbereiden. De kwaliteit van de met grafeen gecoate roosters kan gemakkelijk worden onderzocht met behulp van een low-end transmissie-elektronenmicroscoop (TEM) die is uitgerust met een LaB6-filament.

Protocol

1. Voorbereiding van materialen en accessoires die nodig zijn voor de fabricage van grafeenroosters OPMERKING: Grafeen vervuilt gemakkelijk, wat de efficiëntie van grafeencoating en de kwaliteit van de grafeenroosters vermindert; Daarom is het belangrijk om alle materialen die in contact komen met het grafeen grondig te reinigen. Voorbereiding van materialen en alle stappen moeten in een zuurkast worden uitgevoerd. Verzamel de benodigde materialen die zullen worden gebruikt voor het coaten van de roosters met grafeen (Figuur 2A). Spoel het glaswerk meerdere keren af met gedeïoniseerd (DI) water om stof, pluisjes en olieachtige resten te verwijderen. Gebruik wegwerpdoekjes om glazen dekglaasjes schoon te maken met 75% ethanol en gebruik een air-duster om eventuele verontreinigingen te verwijderen.NOTITIE: Het klemmende TEM-rasterhouderblok dat in dit protocol wordt gebruikt, kan maximaal 45 roosters bevatten. Voor een grote serieproductie van grafeenroosters kunnen 45 roosters of minder tegelijk worden voorbereid. Het wordt echter aanbevolen om te beginnen met een kleine batchproductie (vier tot zes roosters) totdat de methode in het laboratorium is vastgesteld. 2. Bereiding van 0,2 M ammoniumpersulfaat (APS) in water OPMERKING: Deze APS-oplossing wordt gebruikt als etsmiddel om in een latere stap de koperen (Cu) ondersteuning van de grafeen/Cu-plaat te verwijderen. Bereid altijd een verse APS-oplossing voor. Hergebruikte of oude oplossingen zullen koper niet effectief etsen en kunnen in de latere stappen koperresten op het grafeen achterlaten. Spoel een kolf van 500 ml met gedeïoniseerd water (DI), voeg vervolgens 200 ml DI-water toe en magnetron op maximale instellingen gedurende ongeveer 1 minuut om het water te ontgassen. Voeg 9 g ammoniumpersulfaat toe aan 200 ml DI-water om een oplossing van 0,2 M APS te verkrijgen.LET OP: APS is giftig, het wordt geadviseerd om persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM) te dragen bij het hanteren van APS. Gooi APS-afval weg in een erkend afvalverwerkingsbedrijf. Roer de oplossing met een roerstaaf op een magneetroerder terwijl u de kolf aansluit op een vacuümbron onder een zuurkast.OPMERKING: Het ontgassen van de APS-oplossing helpt de vorming van luchtbellen te voorkomen, wat de efficiëntie van Cu-etsen in stap 6 kan verminderen. 3. Breng grafeen/koper over op een schoon dekglaasje met een stuk vloeipapier OPMERKING: We gebruiken een grafeenfilm van 15 x 15 cm met chemische dampafzetting (CVD) op Cu van een grafeenleverancier. In de handel gekochte monolaagse grafeen/Cu-vellen moeten onder vacuüm worden bewaard. Aangezien grafeen aan beide zijden van Cu wordt gekweekt volgens de CVD-methode, voeren grafeenleveranciers over het algemeen kwaliteitscontroles uit en bevelen ze de betere kant aan voor gebruik. We verwijzen naar deze aanbevolen kant van het grafeen als de “bovenkant”, terwijl de andere kant de “achterkant” is in dit protocol. Knip een stuk vloeipapier in een rechthoekige vorm van ongeveer 20 mm x 40 mm. Dit vloeipapier wordt gebruikt als opvulling voor het grafeen/Cu-vel en absorbeert overtollig methylmethacrylaat (MMA (8.5) MMA EL6) dat wordt gebruikt om het grafeen/Cu-vel te coaten; zorg er daarom voor dat u het in een maat snijdt die groter is dan de grafeen/Cu-plaat die moet worden gebruikt. Gebruik polyimidetape om de vier hoeken van het vloeipapier op de bovenkant van een schoon dekglaasje te plakken dat in een zelfgemaakte spincoater past.NOTITIE: Polyimidetape wordt gebruikt omdat het dun is en gemakkelijk kan worden verwijderd, wat het hanteren gemakkelijk maakt. Haal een stuk van de grafeen/Cu-plaat uit de vacuümopslag. Gebruik een schone en stofvrije schaar om voorzichtig een klein vierkantje van de Cu-grafeenplaat af te knippen dat voldoende is om het aantal te bereiden roosters volledig te bedekken. Voor 25 rasters gerangschikt in een array van 5 x 5, snijdt u bijvoorbeeld een stuk van 18 mm x 18 mm. Leg het grafeen/Cu-vel op het vloeipapier met een schoon, droog pincet. Zorg ervoor dat de achterkant van het grafeen/Cu-vel naar beneden is gericht en pas op dat u het grafeen/Cu-vel niet per ongeluk omdraait, aangezien het moeilijk is om de bovenkant van de achterkant te onderscheiden. Plak de vier hoeken van het grafeen/Cu-vel op het vloeipapier/dekglaasje, zodat de hoeveelheid contact tussen de tape en het grafeen/Cu-vel tot een minimum wordt beperkt, aangezien eventuele gebieden die met tape zijn bedekt, in de volgende stap niet met MMA worden bedekt.NOTITIE: Statische ontlading kan grafeenfilms beschadigen en daarom is het raadzaam om elektrisch geaard te blijven en de accumulatie van statische lading te minimaliseren bij het hanteren van grafeen of grafeenroosters. Dit kan worden bereikt door een aardingsband om de pols te dragen of een geaard metalen voorwerp aan te raken vlak voordat grafeen of grafeenroosters worden gehanteerd. 4. Smeer de enkellaagse grafeen/Cu-plaat in met een dunne laag MMA(8.5)MMA EL6 (MMA) OPMERKING: Nadat de Cu is weggeëtst, zal deze laag MMA de grafeenmonolaag ondersteunen om de behandeling van het grafeenvel in toekomstige stappen mogelijk te maken. MMA-coating maakt ook de visualisatie van de grafeenfilm mogelijk, aangezien een monolaag van grafeen alleen transparant zou zijn. Plaats het dekglaasje met de afgeplakte grafeen/Cu-plaat op een zelfgemaakte spincoater (deze kan worden gemonteerd met behulp van een computerventilator) in een zuurkast (Figuur 2B), zoals eerder beschreven door Han et al.25. Draag een veiligheidsbril, voeg twee druppels MMA toe met behulp van een glazen pipet op het grafeenvel en begin onmiddellijk op maximale snelheid te draaien. Voeg tijdens het draaien nog twee druppels toe in het midden. Draai gedurende 1 min.OPMERKING: Zorg ervoor dat er voldoende MMA is aangebracht om het grafeen volledig te coaten. Als je het niet zeker weet, voeg dan nog een paar druppels toe. Als grafeen niet volledig is gecoat, verschijnen er “gaten” in de film nadat Cu is weggeëtst. Laat 10 minuten aan de lucht drogen in een zuurkast. 5. Verwijder grafeen aan de achterkant van de grafeen/Cu-plaat OPMERKING: Grafeen dat aan de achterkant van het koper is gegroeid (de kant die niet is bedekt met MMA) moet worden verwijderd voordat u doorgaat met de volgende stappen, omdat dit overtollige grafeen de effectiviteit van Cu-etsen zal verminderen. We verwijderen dit grafeen door het grafeen bloot te stellen aan plasma, wat kan worden bereikt met behulp van elk gloeiontladingsapparaat dat doorgaans wordt gebruikt om EM-roosters voor te bereiden op biologische monstervoorbereiding. Verwijder voorzichtig de tape en til het MMA-gecoate grafeen/Cu-vel van het dekglaasje met een schoon, droog pincet. Plak het stuk van het MMA/grafeen/Cu-vel met de MMA-kant naar beneden op een schoon en stofvrij glazen dekglaasje. Plaats het dekglaasje met het MMA/grafeen/Cu-vel in het gloeiontladingsapparaat en pas instellingen toe die normaal gesproken worden gebruikt bij het voorbereiden van roosters voor negatieve kleuring of cryoEM-monstervoorbereiding.OPMERKING: Langdurige gloeiontlading moet worden vermeden om oxidatie van Cu aan de achterkant te voorkomen, wat kan leiden tot verontreiniging van koperoxide (CuO) (nano)deeltjes op grafeenfilm. 6. Ets de Cu weg van het MMA/grafeen/Cu-blad in APS-oplossing Giet in een zuurkast 200 ml van de vers gemaakte APS-oplossing in een schone en stofvrije kristalliseerschaal (150 x 75 mm). Verwijder de MMA/grafeen/Cu-plaat van het glasplaatje. Houd bij welke kant de MMA bevat. Om te beginnen met etsen, plaatst u het MMA/grafeen/Cu-vel met de met plasma behandelde Cu-zijde naar beneden op het oppervlak van de APS-oplossing. Bedek het brede glazen bekerglas met een stuk aluminiumfolie of een deksel om te voorkomen dat er stof binnendringt. Incubeer gedurende 3 uur. Als het grootste deel van de Cu na 1 uur nog niet is geëtst, herhaal dan de stappen in secties 2-6 en ga dan verder met de volgende stap.OPMERKING: Als het grootste deel van de Cu na 1 uur nog niet is geëtst, is het waarschijnlijk dat de MMA/grafeenzijde van de film op het oppervlak van de APS-oplossing is geplaatst in plaats van op de Cu-zijde. Cu moet na 3 uur volledig worden geëtst en de MMA/grafeenfilm is kleurloos als Cu volledig is geëtst. Grafeen vervuilt gemakkelijk, dus zorg ervoor dat u alle containers afdekt om ophoping van pluisjes of vettige resten op oppervlakken te voorkomen, omdat dit een negatieve invloed heeft op de kwaliteit van het grafeen. 7. Spoel de MMA/grafeenfilm af in DI-water Vul in een zuurkast een schone en stofvrije kristalliseerschaal met gedistilleerd water. Schep de grafeen-MMA-film voorzichtig op met een schone, stofvrije glazen dekglaasje dat in een hoek van ~45° ten opzichte van het oppervlak van de APS-oplossing is geplaatst. Plaats het glasplaatje in een hoek van bijna 90° ten opzichte van het water en laat het glazen dekglaasje voorzichtig in het water zakken, zodat het MMA/grafeen langzaam van het glaasje glijdt en op het wateroppervlak drijft. Laat de MMA/grafeenfilm 1 uur op het wateroppervlak liggen om eventuele APS af te wassen. 8. Reinig de te coaten roosters met een monolaag grafeen OPMERKING: De roosters waarop het grafeen wordt overgebracht, moeten zo schoon mogelijk zijn om de hechting van het grafeen aan het oppervlak van de roosterfolie te maximaliseren. Commercieel gekochte roosters bevatten vaak resterende verontreinigingen die moeten worden verwijderd voordat grafeen wordt overgedragen. Reinig en droog drie kristalliseerschalen zodat ze stofvrij zijn. Giet in een zuurkast 200 ml chloroform, aceton en isopropylalcohol (IPA) in elk van de drie kristalliseerschalen. Dek de kristalliseerschalen af met aluminiumfolie om de verdamping van de organische oplosmiddelen tot een minimum te beperken.LET OP: Chloroform en aceton veroorzaken huidirritatie en kunnen giftig zijn bij inademing. Beperk de blootstelling aan deze organische oplosmiddelen en draag persoonlijke beschermingsmiddelen. Plaats de basis van het klemmende TEM-roosterhouderblok op de bodem van de eerste kristalliseerschaal met 200 ml chloroform. Breng elk rooster afzonderlijk over van de roosterdoos naar een kuiltje in het roosterhouderblok en zorg ervoor dat de kant van de geraamde folie naar boven wijst. Bedek de kristalliseerschaal met aluminiumfolie, plaats deze op een orbitale schudder en schud zachtjes gedurende 30 minuten. Plaats het metalen deksel op het roosterhouderblok, waardoor de roosters worden vastgezet tijdens het overbrengen naar de volgende kristalliseerschaal. Til het roosterhouderblok voorzichtig met een gebogen vork en een lang pincet uit de kristalliseerschaal en plaats het op de bodem van de tweede kristalliseerschaal met 200 ml aceton. Verwijder het deksel van het blok van de roosterhouder en schud zachtjes op een orbitale schudder gedurende 30 min. Plaats het deksel op het blok van de roosterhouder en breng over naar een kristalliseerschaal met 200 ml IPA-oplossing om acetonresten te verwijderen. Verwijder het deksel van het roosterhouderblok en schud zachtjes gedurende 20 min. Breng de roosters afzonderlijk met de geraamde foliezijde naar boven van het roosterhouderblok over op een glazen petrischaal bedekt met vloeipapier. Droog de roosters minimaal 30 minuten onder de zuurkast en zorg ervoor dat de roosters afgedekt zijn om te voorkomen dat er stof op terechtkomt. 9. Breng de schone roosters over op vloeipapier dat op een roestvrijstalen gaas of geperforeerde lade onder gedemineraliseerd water is geplaatst NOTITIE: Roosters moeten op een vlakke ondergrond onder DI-water worden ondergedompeld, zodat het grafeen op het water kan drijven en op de roosters kan worden neergelaten. Dit kan worden uitgevoerd met behulp van een commerciële roostercoatingtrog of met een petrischaal en een peristaltische pomp, zoals gebruikt voor het genereren van grafeenoxideroosters, zoals beschreven door Palovcak et al.18. Plaats het roestvrijstalen gaas of de bak in een roosterbak en spoel af met gedistilleerd water. Knip het vloeipapier dat iets kleiner is dan het roestvrijstalen gaas/lade en plaats het op het platform, ondergedompeld in het DI-water.NOTITIE: Het vloeipapier is iets kleiner dan het platform om beweging en hantering mogelijk te maken. Leg de gereinigde roosters voorzichtig met de geraamde folie naar boven op het vloeipapier. De roosters zullen waarschijnlijk hydrofoob zijn, dus dompel de roosters verticaal onder in het water, anders kunnen ze buigen door waterspanning. Plaats de roosters in een vierkante reeks zodat ze zo dicht mogelijk bij elkaar staan, maar elkaar niet overlappen (Figuur 2C). De roosters zijn nu klaar om te worden gecoat met een grafeenmonolaag. Vul de roostercoatingbak met meer DI-water zodat het wateroppervlak minimaal 5 mm boven de roosters uitsteekt. 10. Breng grafeen over naar de roosters Schep de MMA/grafeenfilm voorzichtig uit de kristalliseerschaal met een schoon dekglaasje door het dekglaasje langzaam schuin in de trog te laten zakken, op enige afstand van de grafeenfilm. Plaats het dekglaasje onder het grafeen-MMA-vel zodat de randen van het dekglaasje en het dekglaasje evenwijdig zijn, en til het dekglaasje vervolgens verticaal uit het water, waarbij u de MMA/grafeenfilm meeneemt. Breng de MMA/grafeenfilm over naar de trog door het dekglaasje in een hoek van ~45° in het water te laten zakken, zodat de MMA/grafeenfilm loskomt van het dekglaasje en op het wateroppervlak drijft. Plaats de MMA/grafeenfilm direct boven de roosters voordat het waterniveau wordt verlaagd. Gebruik een glazen pasteurpipet waarvan de punt is gesmolten om de opening af te dichten om de positie van de MMA/grafeenfilm voorzichtig te manipuleren. Verlaag het waterniveau langzaam met de spuit, met ongeveer 1,25 ml/min, zodat de MMA/grafeenfilm de roosteroppervlakken volledig bedekt wanneer deze op het filterpapier terechtkomtNOTITIE: Verdere manipulatie van het grafeen-MMA-vel kan nodig zijn om zijn positie boven de roosters te behouden als het waterpeil daalt. Gebruik een schoon, droog pincet om het vloeipapier met de roosters op te tillen tot een schone, droge, stofvrije petrischaal, of breng het hele roestvrijstalen platform over. Laat de MMA/grafeenroosters minimaal 30 minuten aan de lucht drogen onder de zuurkast. Houd de roosters afgedekt met aluminiumfolie of een deksel om verontreiniging door stofdeeltjes te voorkomen. Leg de roosters in een broedstoof en bak de roosters 30 minuten in een broedstoof van 65 °C. Haal de roosters uit de broedstoof en laat ze afgedekt 5 minuten op kamertemperatuur staan om de roosters af te koelen tot kamertemperatuur. 11. MMA verwijderen en de roosters schoonmaken OPMERKING: MMA moet grondig worden afgewassen in aceton om te voorkomen dat er MMA achterblijft op de met grafeen gecoate roosters. Bereid in een zuurkast twee kristalliseerschalen met 200 ml aceton en een kristalliseerschaal met 200 ml isopropanol (IPA) op kamertemperatuur. Dek de kristalliseerschalen af met aluminiumfolie om de verdamping van de organische oplosmiddelen tot een minimum te beperken.LET OP: Draag persoonlijke beschermingsmiddelen bij het hanteren van aceton, aangezien dit huidirritatie kan veroorzaken en schadelijk kan zijn bij inademing. Plaats de basis van het klemmende TEM-roosterhouderblok op de bodem van de eerste kristalliseerschaal met 200 ml verse aceton. Breng elk rooster afzonderlijk over van het vloeipapier naar een kuiltje in het rasterhouderblok en zorg ervoor dat de MMA-zijde naar boven wijst. Bedek de kristalliseerschaal met folie, plaats deze op een orbitale schudder en schud zachtjes gedurende 30 minuten. Plaats het metalen deksel op het roosterhouderblok, waardoor de roosters worden vastgezet tijdens het overbrengen naar de volgende kristalliseerschaal. Til het roosterhouderblok voorzichtig met een gebogen vork en een lang pincet uit de kristalliseerschaal en plaats het op de bodem van de tweede kristalliseerschaal met 200 ml verse aceton. Verwijder het deksel van het blok van de roosterhouder en schud zachtjes op een orbitale schudder gedurende 30 min. Plaats het deksel op het blok van de roosterhouder en breng over naar de kristalliseerschaal met 200 ml IPA-oplossing om acetonresten te verwijderen. Verwijder het deksel van het roosterhouderblok en schud zachtjes gedurende 20 min. Leg de roosters op een kleine glazen petrischaal bedekt met vloeipapier en laat de roosters minimaal 10 minuten aan de lucht drogen. Houd de roosters afgedekt met een deksel om verontreiniging door stofdeeltjes te voorkomen. Roosters zijn klaar voor gebruik of worden overgebracht naar een roosterdoos omwikkeld met aluminiumfolie in een vacuümexsiccator .OPMERKING: Het opslaan van grafeenroosters in een vacuümexsiccator kan besmetting van hydrofobe deeltjes door omgevingsomstandigheden voorkomen. Deze roosters kunnen tot enkele maanden worden bewaard voor gebruik27. 12. Maak grafeenroosters hydrofiel met UV/Ozon behandeling OPMERKING: Grafeen is extreem hydrofoob, wat niet compatibel is met cryoEM-monstervoorbereiding, aangezien blot-plunge-benaderingen een hydrofiel oppervlak vereisen waarop een druppel monster zich gelijkmatig kan verspreiden. Terwijl traditionele gloeiontladingsapparaten kunnen worden geconfigureerd om plasma zachtjes te pulseren om het grafeenoppervlak hydrofiel te maken, hebben deze apparaten de neiging om de dunne grafeenmonolaag te vernietigen. Eerder werd aangetoond dat een UV/ozonreiniger kan worden gebruikt om het oppervlak van het grafeen25 gedeeltelijk van zuurstof te voorzien, waardoor het hydrofiel wordt voor cryoEM-monstervoorbereiding zonder de monolaag te beschadigen. Als u een UV/Ozon-systeem gebruikt dat moet worden geprimed, zet u het systeem aan en vult u de lamp gedurende 10 minuten (zorg er bij deze stap voor dat er geen roosters worden blootgesteld). Terwijl de UV/ozonreiniger aan het primen is, verwijdert u de roosters van de vacuümexsiccator en legt u ze op een schoon dekglaasje. Wanneer het UV/Ozon-systeem gereed is, plaatst u het dekglaasje met de roosters met de grafeenzijde naar boven in de UV/ozonreiniger en stelt u de roosters gedurende 4 minuten bloot aan het ozongas. Gebruik na blootstelling aan ozon de roosters onmiddellijk voor de voorbereiding van cryoEM-monsters.NOTITIE: Bij gebruik van een UV/Ozon-systeem dat moet worden geprimed, moeten roosters in de reiniger worden geplaatst onmiddellijk nadat de lamp gedurende 10 minuten is gevuld, anders zal het te koel zijn om voldoende ozongas te produceren om het grafeen van zuurstof te voorzien voor monstervoorbereiding. Stel de roosters niet langer dan 6 minuten bloot aan het ozongas, omdat dit de grafeenlaag vernietigt.

Representative Results

Succesvolle uitvoering van het hier beschreven fabricageprotocol voor grafeenrasters zal resulteren in EM-rasters die volledig zijn gecoat met een enkele monolaag grafeen. De grafeendekking van de roosters kan worden gecontroleerd met behulp van elke TEM. Aangezien een monolaag schoon grafeen bijna onzichtbaar is in de TEM, moet men deze onderzoeken met behulp van de diffractiemodus van de microscoop en Bragg-vlekken observeren die overeenkomen met de zeshoekige organisatie van de koolstofatomen waaruit het grafeen bestaat (Figuur 3A). Het is normaal om af en toe enkele rimpels van monolaag grafeen waar te nemen, die worden geïntroduceerd tijdens MMA-coating (Figuur 3B). Men kan ook de mate van verontreiniging op het grafeen controleren door een sterk vergroot beeld te verkrijgen in het midden van een van de met grafeen bedekte gaten (Figuur 3C). Indien verkregen met een detector met hoge resolutie, zou een Fouriertransformatie van dit beeld Bragg-vlekken moeten bevatten die overeenkomen met een koolstof-koolstofafstand op 2,14 Å (Figuur 4C). Een monolaag van koolstofatomen produceert niet voldoende elektronenverstrooiing om fasecontrast te genereren, en dus zal een afbeelding van schoon grafeen geen Thon-ringen vertonen die verband houden met de contrastoverdrachtsfunctie in een Fouriertransformatie van het beeld. Het is echter erg moeilijk om besmetting van grafeenroosters te voorkomen nadat ze zijn geproduceerd, en onvoldoende wassen van de EM-roosters of het verwijderen van MMA na grafeencoating zal resulteren in opmerkelijke verontreinigingen op de roosters die zichtbaar zijn in de real-space beelden (Figuur 3C). Zoals te zien is in figuur 4, hebben grafeenroosters een concentrerend effect op een monster, zoals waargenomen bij het vergelijken van 0,5 mg/ml apoferritine wordt toegepast op holle goudroosters met (Figuur 4A) en zonder de grafeenondersteuning (Figuur 4B). Soortgelijke grafeenfabricageprotocollen zijn eerder beschreven om cryoEM-structuren van eiwitten zoals apoferritine op te lossen met een hoge resolutie25,27. Figuur 1: Schema voor het maken van met grafeen gecoate cryoEM-roosters. De belangrijkste stappen in het proces van de fabricage van grafeenrasters worden geïllustreerd. Afkortingen: cryoEM = cryogene elektronenmicroscopie; MMA = methylmethacrylaat; APS = ammoniumpersulfaat. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 2: Benodigde materialen voor het maken van grafeenroosters. (A) Benodigde materialen voor het coaten van cryo-EM-roosters zijn dienovereenkomstig geëtiketteerd. (B) Close-up van de coater met grafeen/Cu-vel geplakt op een vloeipapier op een glasplaatje. De spincoater kan worden geassembleerd door onderdelen te kopen bij een plaatselijke computer/ijzerhandel. (C) Close-up van de roostercoatingtrog die is bevestigd aan een spuit die kan worden gebruikt om het waterpeil te regelen. Roosters worden op een vloeipapier op een roestvrijstalen gaas geplaatst. Het vloeipapier helpt bij het manoeuvreren van de locatie van de rasters, zodat het grafeenvel erop kan worden afgestemd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 3: Een representatief beeld van een diffractiepatroon en heldere veldbeelden van een grafeenraster dat rimpels of MMA-verontreiniging vertoont . (A) EM-roosters bedekt met een monolaag grafeen zullen Bragg-pieken vertonen die overeenkomen met het zeshoekige rooster van het grafeen wanneer ze worden afgebeeld in een TEM in diffractiemodus. De Bragg-piek die overeenkomt met de koolstof-koolstofafstand van 2,14 Å is omcirkeld en aangegeven met een pijl. (B) Een helderveldafbeelding van een monolaag grafeenraster met enkele rimpels (aangeduid met een pijl) in de grafeenmonolaag. (C) Een helderveldbeeld van monolaags grafeen met MMA-verontreiniging (aangeduid met een pijl). Schaalbalken = 100 nm (B,C). Afkortingen: EM = elektronenmicroscopie; MMA = methylmethacrylaat. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 4: Apoferritine op met grafeen bedekte goudroosters: (A) CryoEM-microfoto van 0,5 mg/ml apoferritine op met grafeen bedekte goudroosters. (B) Apoferritine dat in dezelfde concentratie in beeld is gebracht, is in een aanzienlijk lagere concentratie zichtbaar wanneer het wordt bereid met behulp van holle goudroosters zonder grafeen. (C) FFT van de cryoEM-microfoto van 0,5 mg/ml apoferritine op met grafeen bedekte goudroosters, waarbij de Bragg-pieken overeenkomen met het zeshoekige grafeenrooster. Schaalbalken = 100 nm (A,B). Afkortingen: cryoEM = cryogene elektronenmicroscopie; FFT = snelle Fouriertransformatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussion

Het bewaren van biologische monsters in een dunne laag glasachtig ijs is een uiterst belangrijke stap voor de bepaling van de cryoEM-structuur met hoge resolutie. Onderzoekers stuiten echter vaak op problemen die voortvloeien uit interacties met de AWI, die voorkeursoriëntatie, complexe demontage, denaturatie en aggregatie introduceert. Bovendien kunnen monsters niet altijd voldoende worden geconcentreerd om het dunne ijs te vullen dat over de gaten van een gefenestreerde film hangt. Verschillende onderzoeksgroepen hebben methoden ontwikkeld om EM-roosters te coaten met een monolaag van grafeen om enkele van deze beperkingen te helpen overwinnen 24,25,26,27,28,29,30, en grafeenroosters zijn met groot succes gebruikt. Hier geven we stap-voor-stap instructies voor het effectief intern voorbereiden van batches grafeenroosters en het onderzoeken van de kwaliteit van de grafeenroosters door TEM. We benadrukken dat bijzondere voorzichtigheid moet worden betracht tijdens enkele van de kritieke stappen, die we hieronder schetsen.

Grafeen heeft een sterke neiging om verontreinigingen in de lucht aan te trekken. Daarom is het tijdens het fabricageproces van grafeenroosters belangrijk om ervoor te zorgen dat alle gereedschappen die in contact komen met de grafeen/Cu-plaat of de roosters schoon en stofvrij zijn. Glazen dekglaasjes die worden gebruikt om grafeen over te brengen, kunnen worden gereinigd door te spoelen met ethanol en gedistilleerd water of met een air-duster. Het is ook aan te raden om onder een zuurkast te werken en grafeenplaten en roosters te allen tijde af te dekken met folie of een schone glasplaat. Stof of verontreinigingen op de roosters kunnen ervoor zorgen dat grafeen zich niet goed hecht aan de EM-roosters. Bij het hanteren van grafeen of met grafeen gecoate roosters is het belangrijk om elektrisch geaard te zijn om schade aan de grafeenfilm door statische ontlading te voorkomen. Statische ontlading kan worden voorkomen door een aardingsband aan de pols te gebruiken, een geaard metalen voorwerp aan te raken telkens wanneer grafeen of grafeenroosters worden gehanteerd, en/of geen handschoen te dragen aan de hand die het pincetvasthoudt 24.

Aangezien een monolaag van grafeen erg dun is (de breedte van een koolstofatoom), is het belangrijk om grafeen te ondersteunen met een organische laag zoals MMA of poly-MMA (PMMA) tijdens de overdracht van grafeen naar roosters. PMMA is het meest gebruikte materiaal voor grafeenoverdracht. PMMA heeft echter een sterke affiniteit met grafeen en kan vaak leiden tot polymeerverontreiniging op de grafeenfilm. MMA wordt in dit protocol gebruikt, omdat het minder restverontreiniging achterlaat25. Zowel PMMA als MMA hebben echter het nadeel dat ze rimpels en scheuren vormen die in sommige delen van de grafeenfilm kunnen worden waargenomen (Figuur 3B). Het kan een uitdaging zijn om deze rimpels te vermijden, omdat ze vaak voorkomen tijdens de groei van grafeen door de CVD-methode31. Recent is een methode ontwikkeld voor het kweken van ultraplat grafeen zonder rimpels, waarbij de koperfolie wordt vervangen door een Cu(111)/saffierwafer als groeisubstraat32.

Op basis van onze ervaring is het beter om grafeen/Cu-platen aan te schaffen en het grafeen met MMA in eigen huis te ondersteunen dan met polymeer bedekte Cu-grafeenplaten van fabrikanten te kopen, die broos worden na het etsen van koper en moeilijk te hanteren zijn in volgende stappen. De spincoater die we gebruikten voor MMA-coating kan goedkoop worden gebouwd met onderdelen van een lokale computer/bouwmarkt, zoals eerder beschreven25.

Tijdens de stap van MMA-coating is het belangrijk om het volledige grafeenoppervlak op de Cu-grafeenplaat met MMA te bedekken. Nadat de Cu is weggeëtst, wordt MMA-grafeen semi-transparant en zien gebieden zonder MMA-dekking eruit als lege gaten. Om MMA-coating aan de koperzijde te voorkomen, is het belangrijk om er tijdens het coaten een klein stukje vloeipapier onder te leggen, zodat het overtollige MMA opneemt dat uit de CVD-film spint.

Na het etsen en spoelen is de MMA/grafeenplaat klaar om te worden overgebracht naar EM-roosters met behulp van een commercieel of zelfgemaakt trogsysteem met een spuit of peristaltische pomp om het waterniveau te regelen. Voorafgaand aan de overdrachtsstap is het belangrijk om de roosters grondig voor te spoelen in opeenvolgende baden met chloroform, aceton en IPA. Het bakken van met grafeen gecoate roosters op 65 °C helpt de integriteit van grafeen te behouden en bevordert de adsorptie van grafeen aan de roosters. Tot slot is het belangrijk om MMA contaminatie op de roosters te voorkomen en MMA grondig te verwijderen in een aceton bad en de roosters schoon te maken in IPA. Eventuele ongewassen MMA-resten worden waargenomen op EM-roosters en verminderen de signaal-ruisverhouding van de beelden (Figuur 3C). Het aceton-IPA-wasproces kan worden herhaald om de grafeenoppervlakken verder te reinigen.

Om grafeenroosters hydrofiel te maken, hebben we de roosters blootgesteld aan UV/Ozon. Verschillende modellen UV/ozonreinigers kunnen geoptimaliseerd moeten worden om de grafeenlaag voldoende zuurstof te geven voor de voorbereiding van cryoEM-monsters zonder het grafeen te beschadigen. Ongeacht het systeem is het van cruciaal belang om deze roosters onmiddellijk na de UV/Ozon-behandeling te gebruiken voor het aanbrengen van cryoEM-monsters. Alternatieve methoden om grafeenroosters hydrofiel te maken worden beschreven in andere studies33,34.

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We danken Dr. Xiao Fan voor nuttige discussies bij het vaststellen van deze methoden bij Scripps Research. B.B. werd ondersteund door een postdoctoraal onderzoeksbeurs van de Hewitt Foundation for Medical Research. W.C. wordt ondersteund door een predoctorale beurs van de National Science Foundation. D.E.P wordt ondersteund door de subsidie van de National Institutes of Health (NIH) NS095892 aan GCL. Dit project werd ook ondersteund door NIH-subsidies GM142196, GM143805 en S10OD032467 aan GCL.

Materials

70% EtOH Pharmco (190 pf EtOH) 241000190CSGL
Acetone Sigma Aldrich 650501-4L
Ammonium persulfate (APS) Sigma Aldrich 215589-500g Hazardous; use extreme caution
Chloroform Sigma Aldrich C2432-1L
Clamping TEM Grid Holder Block for 45 Grids PELCO 16830-45
Computer fan Amazon (Noctua) B07CG2PGY6
Cover slip Bellco Glass 1203J71 Standard cover slips
Crystallizing dish Pyrex 3140-100
Electronics duster Falcon Safety Products 75-37-6
Falcon Dust-off Air Duster Staples N/A
Filter papers Whatman 1001-055
Fine tip tweezer Dumont 0508-L4-PO
Flask Pyrex 4980-500
Fork Supermarket N/A
Glass pasteur pipette VWR 14672-608
Graphene/Cu Graphenea N/A CVD monolayer graphene cu
Grid Coating Trough Ladd Research Industries 10840 Fragile
Isopropanol Fisher Scientific 67-63-0
Kapton Tape Amazon (MYJOR) MY-RZY001 Polyimide tape
Kimwipes Fisher Scientific 06-666
Long twzeer Cole Parmer Essentials UX-07387-15
Metal grid holder Ted Pella 16820-81
MMA(8.5)MMA EL 6 KAYAKU Advanced Materials M31006 0500L 1GL Flammable
Model 10 Lab Oven Quincy Lab, Inc. FO19013
Petri dish Pyrex 3610-102
Plasma cleaner (Solarus 950) Gatan, Inc. N/A
Scissors Fiskars 194813-1010
Standard Analog Orbital Shaker VWR 89032-088
UltrAuFoil R1.2/1.3 – Au300 Quantifoil N/A Holey gold grids
Ultraviolet Ozone Cleaning Systems UVOCS model T10X10/OES
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referenzen

  1. Li, X., Zheng, S. Q., Egami, K., Agard, D. A., Cheng, Y. Influence of electron dose rate on electron counting images recorded with the K2 camera. Journal of Structural Biology. 184 (2), 251-260 (2013).
  2. Tang, G., et al. EMAN2: An extensible image processing suite for electron microscopy. Journal of Structural Biology. 157 (1), 38-46 (2007).
  3. Zivanov, J., et al. New tools for automated high-resolution cryo-EM structure determination in RELION-3. eLife. 7, 1-22 (2018).
  4. Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. CryoSPARC: Algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
  5. Grigorieff, N., Harrison, S. C. Near-atomic resolution reconstructions of icosahedral viruses from electron cryo-microscopy. Current Opinion in Structural Biology. 21 (2), 265-273 (2011).
  6. Nakane, T., et al. Single-particle cryo-EM at atomic resolution. Nature. 587 (7832), 152-156 (2020).
  7. Zhang, K., Pintilie, G. D., Li, S., Schmid, M. F., Chiu, W. Resolving individual atoms of protein complex by cryo-electron microscopy. Cell Research. 30 (12), 1136-1139 (2020).
  8. Yip, K. M., Fischer, N., Paknia, E., Chari, A., Stark, H. Atomic-resolution protein structure determination by cryo-EM. Nature. 587 (7832), 157-161 (2020).
  9. Schultz, P. Cryo-electron microscopy of vitrified specimens. Quarterly Reviews of Biophysics. 21 (2), 129-228 (1988).
  10. Nguyen, H. P. M., McGuire, K. L., Cook, B. D., Herzik, M. A. Manual blot-and-plunge freezing of biological specimens for single-particle cryogenic electron microscopy. Journal of Visualized Experiments. 2022 (180), 1-16 (2022).
  11. Glaeser, R. M. Proteins, interfaces, and cryo-em grids. Current Opinion in Colloid & Interface Science. 25 (3), 289-313 (2016).
  12. Glaeser, R. M., Han, B. -. G. Opinion: hazards faced by macromolecules when confined to thin aqueous films. Biophysics Reports. 3 (1-3), 1-7 (2017).
  13. Han, B. G., Watson, Z., Cate, J. H. D., Glaeser, R. M. Monolayer-crystal streptavidin support films provide an internal standard of cryo-EM image quality. Journal of Structural Biology. 200 (3), 307-313 (2017).
  14. Noble, A. J., et al. Routine single particle CryoEM sample and grid characterization by tomography. eLife. 7, 1-42 (2018).
  15. Drulyte, I., et al. Approaches to altering particle distributions in cryo-electron microscopy sample preparation. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 74 (6), 560-571 (2018).
  16. Liu, N., Wang, H. W. Better cryo-EM specimen preparation: how to deal with the air-water interface. Journal of Molecular Biology. 435 (9), 167926 (2022).
  17. Noble, A. J., et al. Reducing effects of particle adsorption to the air-water interface in cryo-EM. Nature Methods. 15 (10), 793-795 (2018).
  18. Palovcak, E., et al. A simple and robust procedure for preparing graphene-oxide cryo-EM grids. Journal of Structural Biology. 204 (1), 80-84 (2018).
  19. Patel, A., Toso, D., Litvak, A., Nogales, E. Efficient graphene oxide coating improves cryo-EM sample preparation and data collection from tilted grids. bioRxiv. , (2021).
  20. Marr, C. R., Benlekbir, S., Rubinstein, J. L. Fabrication of carbon films with ~500nm holes for cryo-EM with a direct detector device. Journal of Structural Biology. 185 (1), 42-47 (2014).
  21. Pantelic, R. S., Meyer, J. C., Kaiser, U., Baumeister, W., Plitzko, J. M. Graphene oxide: A substrate for optimizing preparations of frozen-hydrated samples. Journal of Structural Biology. 170 (1), 152-156 (2010).
  22. Pantelic, R. S., et al. Graphene: substrate preparation and introduction. Journal of Structural Biology. 174 (1), 234-238 (2011).
  23. Russo, C. J., Passmore, L. A. Progress towards an optimal specimen support for electron cryomicroscopy. Current Opinion in Structural Biology. 37, 81-89 (2016).
  24. Passmore, L. A., Russo, C. J. Specimen preparation for high-resolution cryo-EM. Methods in Enzymology. 579, 51-86 (2016).
  25. Han, Y., et al. High-yield monolayer graphene grids for near-atomic resolution cryoelectron microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (2), 1009-1014 (2020).
  26. Zheng, L., et al. Robust ultraclean atomically thin membranes for atomic-resolution electron microscopy. Nature Communications. 11 (1), 541 (2020).
  27. Ahn, E., Kim, B., Cho, U. -. S. Batch production of high-quality graphene grids for cryo-EM: cryo-EM structure of Methylococcus capsulatus soluble methane monooxygenase hydroxylase. bioRxiv. (Cvd), (2021).
  28. Naydenova, K., Peet, M. J., Russo, C. J. Multifunctional graphene supports for electron cryomicroscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (24), 11718-11724 (2019).
  29. Fan, H., Sun, F. Developing graphene grids for cryoelectron microscopy. Frontiers in Molecular Biosciences. 9, 937253 (2022).
  30. D’Imprima, E., et al. Protein denaturation at the air-water interface and how to prevent it. eLife. 8, e42747 (2019).
  31. Zhang, X., et al. Evolution of copper step beams during graphene growth by CVD method. Applied Surface Science. 610, 155518 (2023).
  32. Zheng, L., et al. Uniform thin ice on ultraflat graphene for high-resolution cryo-EM. Nature Methods. 20 (1), 123-130 (2023).
  33. Fujita, J., et al. Epoxidized graphene grid for highly efficient high-resolution cryoEM structural analysis. Scientific Reports. 13, 2279 (2023).
  34. Lu, Y., et al. Functionalized graphene grids with various charges for single-particle cryo-EM. Nature Communications. 13, 6718 (2022).

Tags

Cryoelectron MicroscopyGrapheneMonolayerSample PreparationAir-water InterfaceHydrophobic EffectDenaturationAggregationComplex DissociationPreferred OrientationBackground NoiseProtein Concentration

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Diesen Artikel zitieren
Basanta, B., Chen, W., Pride, D. E., Lander, G. C. Fabrication of Monolayer Graphene-Coated Grids for Cryoelectron Microscopy. J. Vis. Exp. (199), e65702, doi:10.3791/65702 (2023).
Zitat herunterladen
Nachdrucke und Berechtigungen

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image