用于冷冻电子显微镜的单层石墨烯涂层网格的制备

1. 制备石墨烯网格所需的材料和配件 注：石墨烯容易被污染，这会降低石墨烯涂层的效率和石墨烯网格的质量;因此，彻底清洁所有与石墨烯接触的材料非常重要。材料的准备和所有步骤都应在通风橱中进行。 收集将用于用石墨烯涂覆网格的必要材料（图2A）。 用去离子 （DI） 水冲洗玻璃器皿数次，以去除任何灰尘、棉绒和油性残留物。 使用一次性湿巾用 75% 乙醇清洁玻璃盖玻片，并使用空气除尘器去除任何污染物。注意： 本协议中使用的夹紧 TEM 网格支架块最多可容纳 45 个网格。对于石墨烯网格的大批量生产，一次可以准备45个或更少的网格。但是，建议从小批量生产（四到六个网格）开始，直到在实验室中建立方法。 2.0.2 M过硫酸铵（APS）水溶液的制备 注意：该 APS 溶液用作蚀刻剂，以在后续步骤中从石墨烯/铜片中去除铜 （Cu） 载体。始终准备新鲜的 APS 溶液。重复使用或旧的溶液将无法有效地蚀刻铜，并可能在后续步骤中在石墨烯上留下铜残留物。 用去离子水 （DI） 水冲洗 500 mL 烧瓶，然后加入 200 mL 去离子水，并使用最大设置微波加热约 1 分钟以使水脱气。 将 9 g 过硫酸铵加入 200 mL 去离子水中，产生 0.2 M APS 的溶液。注意： APS 有毒，建议在处理 APS 时穿戴个人防护设备 （PPE）。在经批准的废物处理厂处理 APS 废物中处理。 用磁力搅拌器上的搅拌棒搅拌溶液，同时将烧瓶连接到通风橱下的真空源。注意：APS 溶液脱气将有助于防止气泡的形成，气泡会降低步骤 6 中 Cu 蚀刻的效率。 3. 用一张吸墨纸将石墨烯/铜转移到干净的盖玻片上 注意：我们在铜上使用石墨烯供应商的 15 x 15 厘米化学气相沉积 （CVD） 石墨烯薄膜。商业购买的单层石墨烯/铜片应在真空下储存。由于石墨烯是通过CVD方法在Cu的两面生长的，因此石墨烯供应商通常会进行质量检查并推荐更好的一面使用。在本协议中，我们将石墨烯的这一推荐侧称为“顶部”侧，而另一侧称为“背面”。 将一张吸墨纸切成大约 20 mm x 40 mm 的矩形。该吸墨纸用作石墨烯/铜片的填充物，将吸收用于涂覆石墨烯/铜片的过量甲基丙烯酸甲酯（MMA（8.5）MMA EL6）;因此，一定要将其切割成比要使用的石墨烯/铜片更大的尺寸。 使用聚酰亚胺胶带将吸墨纸的四个角粘在干净的盖玻片顶部，该盖玻片将适合自制的旋涂机。注意： 使用聚酰亚胺胶带是因为它很薄且易于取下，因此易于处理。 从真空存储中取出一块石墨烯/铜片。 使用干净无尘的剪刀小心地剪下一小块铜石墨烯片，足以完全覆盖要准备的网格数量。例如，对于以 5 x 5 阵列排列的 25 个网格，切割一块 18 mm x 18 mm 的网格。用干净、干燥的镊子将石墨烯/铜片放在吸墨纸上。确保石墨烯/铜片的背面朝下，注意不要意外翻转石墨烯/铜片，因为很难从背面辨别顶部。 将石墨烯/铜片的四个角粘在吸墨纸/盖玻片上，最大限度地减少胶带与石墨烯/铜片之间的接触量，因为在下一步中，任何被胶带覆盖的区域都不会被MMA覆盖。注意：静电放电会损坏石墨烯薄膜，因此，建议在处理石墨烯或石墨烯网格时保持电气接地并尽量减少静电荷的积累。这可以通过在处理石墨烯或石墨烯网格之前立即佩戴手腕接地带或触摸接地的金属物体来实现。 4.在单层石墨烯/铜片上涂上一层薄薄的MMA（8.5）MMA EL6（MMA） 注意：在Cu被蚀刻掉后，这层MMA将支持石墨烯单层，以便在以后的步骤中处理石墨烯片。MMA涂层还可以使石墨烯薄膜可视化，因为单层石墨烯是透明的。 将带有胶带石墨烯/铜片的盖玻片放在通风橱内的自制旋涂机（可以使用计算机风扇组装）上（图2B），如Han等人25先前描述的那样。 戴上护目镜，使用玻璃移液管在石墨烯片上加入两滴MMA，然后立即开始以最大速度旋转。 旋转时，在中心再加两滴。旋转 1 分钟。注意：确保已应用足够的MMA以完全涂覆石墨烯。如果不确定，请再加几滴。如果石墨烯没有完全涂覆，铜被蚀刻掉后，薄膜上会出现“孔洞”。 在通风橱内风干 10 分钟。 5.去除石墨烯/Cu片背面的石墨烯 注意：在进行后续步骤之前，必须去除在铜背面（未涂有MMA的一侧）生长的石墨烯，因为这种过量的石墨烯会降低Cu蚀刻的有效性。我们通过将石墨烯暴露在等离子体中来去除这种石墨烯，这可以使用任何通常用于制备用于生物样品制备的电磁网格的辉光放电装置来实现。 小心地取下胶带，然后用干净、干燥的镊子从盖玻片上取下涂有 MMA 的石墨烯/铜片。 将MMA/石墨烯/铜片的一块，MMA面朝下，粘在干净无尘的玻璃盖玻片上。 将装有MMA/石墨烯/铜片的盖玻片放入辉光放电装置中，并应用通常在制备用于阴性染色或冷冻电镜样品制备的网格时使用的设置。注意：应避免长时间的辉光放电，以防止背面的铜氧化，这可能导致石墨烯薄膜上的氧化铜 （CuO）（纳米）颗粒受到污染。 6. 在APS溶液中蚀刻掉MMA/石墨烯/铜片上的铜 在通风橱中，将 200 mL 新鲜制备的 APS 溶液倒入干净无尘的结晶盘 （150 x 75 mm） 中。 从载玻片上取下MMA/石墨烯/铜片。跟踪哪一侧包含 MMA。 要开始蚀刻，将等离子体处理的铜面朝下的 MMA/石墨烯/铜片放在 APS 溶液的表面上。用一块铝箔或盖子盖住宽玻璃烧杯，以防止灰尘进入。 孵育3小时。如果大部分铜在1小时后没有蚀刻，请重复第2-6节中的步骤，然后继续下一步。注意：如果大部分Cu在1小时后没有蚀刻，则薄膜的MMA /石墨烯侧很可能已放置在APS溶液的表面上，而不是Cu侧。Cu应在3小时后完全蚀刻，如果Cu完全蚀刻，MMA/石墨烯膜是无色的。石墨烯很容易被污染，所以一定要盖住任何容器，以避免表面上堆积棉绒或任何油腻的残留物，因为这会对石墨烯的质量产生负面影响。 7.用去离子水冲洗MMA/石墨烯薄膜 在通风橱中，用去离子水填充干净无尘的结晶盘。 用干净、无尘的玻璃盖玻片轻轻舀起石墨烯-MMA薄膜，该盖玻片相对于APS溶液表面呈~45°角。 将载玻片与水面成近 90° 角放置，然后轻轻地将玻璃盖玻片放入水中，使 MMA/石墨烯慢慢从载玻片上滑落并漂浮在水面上。 将MMA /石墨烯薄膜留在水面上1小时以洗掉任何APS。 8.清洁要涂上单层石墨烯的网格 注意：石墨烯将转移到的网格必须尽可能干净，以最大限度地将石墨烯附着在网格箔表面上。商业购买的网格通常含有残留污染物，必须在石墨烯转移之前去除这些污染物。 清洁并干燥三个结晶盘，使其无灰尘。 在通风橱中，将 200 mL 氯仿、丙酮和异丙醇 （IPA） 倒入三个结晶培养皿中的每一个。用铝箔覆盖结晶皿，以尽量减少有机溶剂的蒸发。注意：氯仿和丙酮会引起皮肤刺激，吸入可能有毒。限制接触这些有机溶剂并穿戴个人防护装备。 将夹紧TEM网格支架块的底部放在含有200mL氯仿的第一个结晶皿的底部。 将每个网格从网格盒单独转移到网格支架块中的孔中，确保开窗膜面朝上。用铝箔盖住结晶皿，将其放在轨道振荡器上，轻轻摇动30分钟。 将金属盖放在网格支架块上，这将在转移到下一个结晶盘的过程中固定网格。用弯曲的叉子和长镊子小心地将网格支架块从结晶盘中取出，并将其放置在含有 200 mL 丙酮的第二个结晶盘的底部。从网格支架块上取下盖子，在轨道振荡器上轻轻摇晃30分钟。 将盖子放在网格支架块上，然后转移到含有 200 mL IPA 溶液的结晶盘中以清除丙酮残留物。从网格支架块上取下盖子，轻轻摇晃 20 分钟。 单独将网格从网格支架块中取出，使开窗膜面朝上，转移到覆盖有吸墨纸的玻璃培养皿上。 在通风橱下将网格干燥至少 30 分钟，确保网格被覆盖以防止灰尘落在上面。 9. 将干净的网格转移到吸墨纸上，放在不锈钢丝网或穿孔托盘上的去离子水 注意：网格必须浸没在平坦表面上的去离子水下，以便石墨烯可以漂浮在水面上并降低到网格上。这可以使用商业网格涂层槽或培养皿和蠕动泵进行，如Palovcak等人所述，用于生成氧化石墨烯网格18。 将不锈钢网或托盘放入网格涂层槽中，并用去离子水冲洗。 剪下比不锈钢网/托盘略小的吸墨纸，将其放在平台顶部，浸入去离子水中。注意：吸墨纸比平台略小，以便移动和处理。 轻轻地转移清洁的网格，使开窗膜面朝上，放在吸墨纸的顶部。网格可能是疏水的，因此请将网格垂直浸入水中，否则它们可能会因水张力而弯曲。将网格放置在方形阵列中，使它们尽可能彼此靠近，但不重叠（图2C）。 网格现在已经准备好涂上石墨烯单层。用更多的去离子水填充网格涂层槽，使水面至少高于网格 5 毫米。 10.将石墨烯转移到网格中 小心地用干净的盖玻片从结晶盘中舀出MMA /石墨烯薄膜，方法是将盖玻片以一定角度缓慢降低到槽中，距离石墨烯薄膜一定距离。将盖玻片放置在石墨烯-MMA片的下方，使片的边缘与盖玻片平行，然后将盖玻片垂直抬出水面，带上MMA/石墨烯薄膜。 将盖玻片以~45°角下降到水中，将MMA/石墨烯膜转移到槽中，使MMA/石墨烯膜从盖玻片上分离并漂浮在水面上。 在水位降低之前，将MMA/石墨烯薄膜直接放置在网格上方。使用吸头已熔化的玻璃巴斯德移液管密封开口，以小心地操纵MMA /石墨烯薄膜的位置。 用注射器以大约 1.25 mL/min 的速度缓慢降低水位，使 MMA/石墨烯薄膜在落在滤纸上时完全覆盖网格表面注意：当水位下降时，可能需要进一步操作石墨烯-MMA片，以保持其在网格上方的位置。 使用一把干净、干燥的镊子将固定网格的吸墨纸提起到干净、干燥、无尘的培养皿中，或转移整个不锈钢平台。 在通风橱下风干MMA /石墨烯网格至少30分钟。保持网格用铝箔或盖子覆盖，以防止灰尘颗粒污染。 将网格转移到培养箱中，并在65°C培养箱中烘烤网格30分钟。 从培养箱中取出网格，并在室温下盖住它们5分钟，以将网格冷却至室温。 11. 移除 MMA 并清洁网格 注意：MMA必须在丙酮中彻底洗掉，以防止石墨烯涂层网格上残留任何MMA。 在通风橱中，在室温下准备两个含有 200 mL 丙酮的结晶培养皿和一个含有 200 mL 异丙醇 （IPA） 的结晶培养皿。用铝箔覆盖结晶皿，以尽量减少有机溶剂的蒸发。注意：处理丙酮时请穿戴个人防护装备，因为它会引起皮肤刺激，如果吸入可能有害。 将夹紧TEM网格支架块的底部放在含有200mL新鲜丙酮的第一个结晶皿的底部。 将每个网格从印迹纸单独转移到网格支架块中的孔中，确保 MMA 侧朝上。用箔纸盖住结晶皿，将其放在轨道振荡器上，轻轻摇动30分钟。 将金属盖放在网格支架块上，这将在转移到下一个结晶盘的过程中固定网格。用弯曲的叉子和长镊子小心地将网格支架块从结晶盘中取出，并将其放置在含有 200 mL 新鲜丙酮的第二个结晶盘的底部。从网格支架块上取下盖子，在轨道振荡器上轻轻摇晃30分钟。 将盖子放在网格支架块上，然后转移到装有 200 mL IPA 溶液的结晶盘中，以清除丙酮残留物。从网格支架块上取下盖子，轻轻摇晃 20 分钟。 将网格转移到覆盖有吸墨纸的小玻璃培养皿中，并将网格风干至少10分钟。用盖子盖住网格，以防止灰尘颗粒污染。 网格已准备好使用或转移到真空干燥器内用铝箔包裹的网格盒中。注意：将石墨烯网格存放在真空干燥器内可以防止环境条件下的疏水颗粒污染。这些网格在使用前可以存放长达几个月27. 12.通过紫外线/臭氧处理使石墨烯网格具有亲水性 注：石墨烯具有极强的疏水性，这与冷冻电镜样品制备不兼容，因为印迹浸入方法需要亲水表面，一滴样品可以均匀地分布在上面。虽然传统的辉光放电器件可以配置为温和地脉冲等离子体，使石墨烯表面具有亲水性，但这些器件往往会破坏薄的石墨烯单层。先前表明，紫外线/臭氧清洁剂可用于对石墨烯25 的表面进行部分氧化，使其在冷冻电镜样品制备中具有亲水性，而不会损坏单层。 如果使用需要灌注的紫外线/臭氧系统，请打开系统并灌注灯 10 分钟（在此步骤中，确保没有网格暴露）。当紫外线/臭氧清洁剂启动时，从真空干燥器中取出网格并将它们转移到干净的盖玻片上。 当UV / Ozone系统准备就绪时，将包含网格的盖玻片（石墨烯面朝上）放入UV /臭氧清洁剂中，并将网格暴露在臭氧气体中4分钟。 暴露于臭氧后，立即使用网格进行冷冻电镜样品制备。注意：如果使用需要灌注的紫外线/臭氧系统，则必须在灯灌注 10 分钟后立即将网格放入清洁器中，否则会太冷而无法产生足够的臭氧气体来氧化石墨烯用于样品制备。不要将网格暴露在臭氧气体中超过 6 分钟，因为它会破坏石墨烯层。