Uma introdução ao processamento, ajuste e interpretação de dados de absorção transitória

A espectroscopia de absorção transiente (AT) é uma técnica espectroscópica resolvida no tempo que monitora a evolução de espécies fotoexcitadas através de mudanças dependentes do tempo em seu espectro de absorção após a excitação com um pulso de luz. Como a AT é uma técnica absortiva, sinais espectroscópicos que surgem de estados que sofrem transições radiativas (isto é, estados que tipicamente emitem um fóton) e transições não radiativas (estados que são tipicamente não fluorescentes e sofrem conversão interna, cruzamento entre sistemas ou participam de fotorreações) podem ser identificados e sua evolução acompanhada ^1,2. Dependendo das especificidades da fonte de excitação e do método de detecção, o TA permite o acesso à cinética de femtosegundos para além de microssegundos e do UV para o infravermelho distante, tornando-o uma ferramenta espectroscópica versátil. A comercialização de espectrômetros de AT avançou significativamente nas últimas décadas, levando a que mais laboratórios e instalações tivessem acesso a essa poderosa técnica².

Os sistemas TA modernos são capazes de produzir grandes conjuntos de dados com alta resolução energética e temporal. Os conjuntos de dados geralmente assumem a forma de uma matriz 2D de valores de diferença de transmitância ou absorbância em função do comprimento de onda e do atraso de tempo em relação ao pulso de excitação. Este conjunto de dados pode ser visto como um mapa de calor bidimensional ou um mapa topográfico tridimensional. A interpretação desses dados tornou-se mais complexa à medida que os pesquisadores se esforçam para incluir todo o conjunto de dados ao gerar os ajustes que melhor descrevem seu sistema de interesse³.

Embora a AT possa cobrir uma ampla gama de comprimentos de onda e escalas de tempo, este protocolo se concentra em uma de suas formas mais amplamente acessíveis⁴: a espectroscopia de banda larga na região UV-visível impulsionada por um laser pulsado de femtossegundo. Um esquema ^5,6 desse instrumento é apresentado na Figura 1. O experimento começa pegando um pulso do laser e dividindo-o em duas cópias. Uma cópia do pulso, chamada de "bomba", é usada para excitar a amostra. Um dispositivo como um amplificador paramétrico óptico (OPA) é tipicamente usado para transformar o pulso da bomba no comprimento de onda de excitação desejado ^5,7. A segunda cópia do pulso, chamada de "sonda", entra em um estágio de atraso mecânico, que pode variar o atraso de tempo entre os pulsos da bomba e da sonda, variando a distância que o pulso percorre. O pulso de sonda de comprimento de onda único é então transformado em um contínuo de luz branca usando um cristal de safira ou fluoreto de cálcio (CaF₂)⁸. O pulso de luz branca é passado através da amostra, e seu espectro é medido usando um detector de banda larga, como uma câmera de dispositivo acoplado à carga (CCD). Medindo as mudanças no espectro do pulso de luz branca com e sem a bomba, as mudanças no espectro de absorção da amostra induzidas pela bomba, ΔA(T), podem ser medidas. Os leitores interessados são direcionados para esta útil revisão⁹ para obter mais informações sobre o processo de detecção.

Em todas as formas de espectroscopia TA, os espectros ΔA(t) são calculados tomando-se a diferença entre a absorção no estado fundamental,_sonda A, e a do estado excitado,_{bomba A+sonda}, em um dado atraso de tempo, t, entre os dois pulsos 2,5,9,10.

(1)

Observe que uma_sonda é equivalente ao espectro de absorção de estado estacionário da amostra e é independente do tempo; a resolução temporal do experimento decorre do atraso entre a bomba e a sonda captada em_bomba+sonda A(t). Uma simulação desses dados é mostrada na Figura 2A.

Em contraste com os espectros de absorção em estado estacionário, os espectros TA podem ter características positivas e negativas devido à diferença encontrada na Equação 1. As características positivas são o resultado de novas espécies absorvedoras criadas pelo pulso da bomba e podem representar estados cromóforos excitados, estados tripletos, rearranjos geométricos, efeitos de solvatação ou fotoprodutos em estado^excitado3. Diretrizes gerais para identificar essas características e atribuí-las a espécies químicas serão apresentadas na Discussão. Características negativas podem surgir tanto da água sanitária no estado fundamental (GSB) quanto da emissão estimulada (SE) (Figura 2B). O GSB é devido à perda da população do estado fundamental após a absorção do pulso da bomba. As moléculas promovidas ao estado excitado não absorvem mais na mesma região que seu estado fundamental; portanto, menos pulso da sonda é absorvido, e a diferença na Equação 1 pode ser negativa nessa região. O GSB é caracterizado por ter a mesma forma espectral que a da absorção do estado fundamental, mas com um sinal oposto. Os sinais SE resultam da emissão de uma espécie em estado excitada estimulada pelo pulso da sonda³. A emissão dessas espécies faz com que mais luz chegue ao detector, o que equivale a ter menos absorção nesses comprimentos de onda. O sinal SE terá uma forma espectral semelhante ao espectro de emissão espontânea da espécie, mas com um sinal negativo e uma ponderação de frequência diferente¹⁰.

Além de informações sobre espécies de estado excitado, os espectros de TA podem conter uma série de artefatos e características estranhas que podem distorcer a dinâmica subjacente e obscurecer a atribuição de bandas de absorção¹¹. O tratamento inadequado desses artefatos na preparação e análise dos dados pode levar à aplicação de modelos fotofísicos inadequados aos dados e, consequentemente, a conclusões equivocadas¹¹. Portanto, a primeira parte deste protocolo se concentra em como processar adequadamente os conjuntos de dados de AT depois que eles são coletados. O objetivo desta seção é fornecer aos pesquisadores iniciantes em AT um conjunto de diretrizes que ajudarão a desenvolver uma intuição e apreciação para a preparação e processamento rigorosos de seus dados.

Depois que um conjunto de dados é processado, uma infinidade de ferramentas e modelos estão disponíveis para ajustar e interpretar os espectros com vários níveis de complexidade e rigor¹⁰. O objetivo da segunda seção deste protocolo é preparar o leitor para aplicar ajuste de comprimento de onda único e análise global aos dados e fornecer orientação sobre quando esses modelos são apropriados para descrever seus dados. O software comercial está agora prontamente disponível para preparar e tratar dados de AT, como o Surface Xplorer^12,13 de sistemas Ultrafast (gratuito para download e uso, consulte a Tabela de Materiais). Outras alternativas gratuitas foram lançadas por pesquisadores acadêmicos, como Glotaran¹⁴. Glotaran é um programa de software livre desenvolvido para análise global e alvo de dados de espectroscopia e microscopia resolvidos no tempo. Ele serve como uma interface gráfica do usuário (GUI) para o pacote R TIMP¹⁴. Além disso, os usuários podem usar linguagens de programação como Python para escrever seus próprios códigos que realizam a análise. Cada um desses softwares e soluções de programação tem características positivas que os tornam contribuições importantes. Para fins deste estudo, podemos apresentar apenas um software para o componente visual desta atividade. Uma discussão aprofundada de cada software de ajuste está além do escopo deste artigo.

Este artigo fornece um procedimento passo a passo para (1) processar dados de AT, (2) ajustar dados de TA usando cinética de comprimento de onda único e análise global, e (3) extrair dados e ajustá-los a outros modelos. Um conjunto de dados representativos de AT é incluído para o leitor usar como prática (Arquivo Suplementar 1 e Arquivo Suplementar 2). Os dados são uma medida de uma amostra de 165 μM de 1,4-bis(5-feniloxazol-2-il)benzeno (POPOP) em etanol excitado a 330 nm e coletado em uma faixa de -5 ps a 5,5 ns. Além disso, uma amostra "em branco" contendo apenas etanol e nenhuma amostra foi coletada nas mesmas condições experimentais em uma faixa de −5 ps a 5 ps, que é usada na preparação dos dados para ajuste (etapa 1). Os espectros foram coletados usando um espectrômetro de absorção transiente ultrarrápido. A amostra foi contida em uma cubeta de 2 mm de comprimento e submetida a agitação constante. O procedimento de processamento e ajuste descrito é baseado no software Surface Xplorer que ajusta os dados no formato *.ufs, e que será aqui chamado de "programa de ajuste". Programas para converter conjuntos de dados em outros formatos para arquivos *.ufs estão disponíveis¹⁵. Embora os detalhes deste protocolo sejam específicos do Surface Xplorer, as etapas a seguir são generalizáveis para qualquer pacote de software, comercial ou construído em casa. Além disso, os resultados do processamento de dados podem ser extraídos e ajustados usando esses outros pacotes de software. Um arquivo de informações de suporte (Arquivo Suplementar 3) fornece conselhos adicionais sobre a adaptação.

1. Preparação dos dados para o ajuste

1. Carregue o conjunto de dados SAMPLE no software Fitting. Os dados aparecerão como mostrado na Figura Suplementar 1.
2. Quando a luz de excitação espalhada estiver presente dentro da janela de detecção óptica do experimento, use a opção Subtrair Luz Espalhada (Figura 2 Suplementar). Se nenhuma luz de excitação dispersa estiver presente nos dados, prossiga para a etapa 1.5.
   NOTA: A luz espalhada é mais comumente observada quando o comprimento de onda de excitação cai dentro da janela óptica. A luz espalhada aparece como uma característica negativa acentuada (água sanitária) no comprimento de onda de excitação (ou alguma ordem de difração, ou comprimento de onda produzido na OPA) que não varia com o tempo.
3. Clique no menu Superfície e, em seguida, clique na opção Subtrair Luz Espalhada (Figura Suplementar 2). Uma nova janela aparecerá.
4. Na nova janela, clique nos botões de seta para definir o número de espectros de fundo como média (Figura 3 Suplementar) para executar a correção de plano de fundo. O uso de dez espectros fornece um bom ponto de partida e o número pode ser ajustado conforme desejado. Clique em Aceitar para executar a subtração (prossiga para a etapa 1.7).
   NOTA: Os espectros de fundo são extraídos dos primeiros espectros presentes no conjunto de dados e, em seguida, avançam temporalmente usando quantos espectros de fundo forem necessários para fornecer a média do sinal de fundo; No entanto, usando muitos começará a usar espectros que contêm o sinal de interesse, então não use muitos. Com dados de janela de tempo longa, o recurso de dispersão pode não aparecer no final da janela de tempo dos dados. Isso pode ocorrer se a janela de tempo exceder o tempo de integração da câmera, ou outros motivos, com base em como o experimento TA é construído. Para corrigir isso, a opção de intervalo de tempo definido pode ser usada conforme descrito em Arquivo Suplementar 3.
5. Para dados em que não há luz dispersa presente na janela óptica, clique no menu Superfície e, em seguida, clique na opção Subtrair plano de fundo .
6. Na janela que aparece, clique nos botões de seta no canto inferior direito de "Número de espectros" para fazer a média (escolha 10), e clique em Aceitar.
   NOTA: Os espectros de fundo nesta opção funcionam da mesma forma que na opção "Subtrair luz dispersa". Começar com dez espectros fornece uma boa média. Mais espectros podem ser usados, mas deve-se tomar cuidado para não usar muitos para evitar a inclusão de espectros contendo sinais de interesse. O manual do usuário do Surface Xplorer descreve as diferenças na correção aplicada para o "Subtrair Luz Espalhada" vs. a correção mais básica "Subtrair Fundo". É importante aplicar a correção adequada para o artefato¹⁶.
7. Os dados próximos às bordas da janela óptica podem ter uma relação sinal-ruído muito baixa, resultante da forma do espectro da sonda e/ou da amostra absorvendo muita luz branca. Dados ruidosos nessas regiões dificultam a análise. Remova essas partes inúteis do espectro. Clique nos comprimentos de onda finais no espectro (bloco inferior esquerdo), digite novos valores (Figura 4 Suplementar) e clique em enter. Escolha um intervalo de comprimento de onda que remova os dados barulhentos nas bordas da janela. Para os dados fornecidos, o intervalo é de 340-680 nm.
8. Finalize o ajuste da janela espectral para a faixa desejada de comprimentos de onda. Clique no menu Surface e, em seguida, clique em Cortar (Figura 5 Suplementar). Uma janela pop-up será exibida.
   1. Clique em OK. Clique no menu Arquivo e, em seguida, clique em Salvar arquivo como. Em seguida, clique em OK. Feche este conjunto de dados.
      NOTA: Tenha cuidado ao cortar, pois a função cortará dados ao longo dos eixos de comprimento de onda e atraso de tempo, excluindo todos os outros dados. Certifique-se de que a janela de atraso de tempo contenha a parte dos dados a ser preservada. Além disso, é altamente recomendável salvar todos os dados cortados como um arquivo novo e rotulado apropriadamente, de modo a deixar a superfície de dados brutos intacta como um backup.
9. Para os dados coletados nas escalas de tempo fs ou ps, uma correção de chirp deve ser aplicada. Abra a superfície de dados apenas com o solvente ou substrato (sem amostra) colhido no mesmo conjunto experimental que os dados. Esse exemplo é chamado de execução de experimento "em branco". Execute o mesmo conjunto de etapas nos dados "em branco" (da etapa 1.2 à etapa 1.8) que foram executadas nos dados de amostra.
   NOTA: É altamente recomendável que tal experimento "em branco" seja executado nas mesmas condições que a amostra, mas com uma janela de tempo mais curta (por exemplo, ~ −5 ps a 5 ps) para garantir um alto número de pontos em torno do tempo zero. Esta corrida "em branco" deve consistir apenas em solvente ou substrato, dependendo do tipo de amostra, e é usada para estabelecer a curvatura do chirp. A preparação do "branco" até este ponto deve seguir a mesma correção de fundo e recorte que os dados de amostra. Se um "branco" não foi executado, a correção de chirp pode ser feita diretamente no conjunto de dados.
10. Inicie o processo de correção de chirp. No bloco do mapa de calor (canto superior esquerdo), clique na mira e arraste o componente de linha vertical para a extremidade azul do espectro. Comece na faixa de comprimento de onda azul perto do início da janela espectral. Clique no menu Cinética e, em seguida, clique em Ajustar Resposta ao Solvente.
    NOTA: A resposta do solvente de ajuste só deve ser executada em uma amostra "em branco" que não gere nenhum sinal além do tempo zero. A tentativa de aplicar essa função de ajuste a um conjunto de dados contendo dados sobre uma molécula ou material de interesse resultará na tentativa do programa de ajustar os dados em vez da IRF (função de resposta do instrumento). Para amostras "em branco", o único sinal presente deve ser um artefato coerente decorrente da modulação de fase cruzada. A modulação de fase cruzada ocorre apenas onde os feixes da bomba e da sonda se sobrepõem e, portanto, fornece um traço da curvatura do chirp que pode ser ajustada usando a opção "Fit Solvent Response". A colocação manual de pontos será necessária para que os dados sem um "branco" que o acompanhe sejam usados para correção e são descritos com mais detalhes no Arquivo Suplementar 3.
11. Uma nova janela "Fit solvent response" é aberta. Clique no botão Ajustar (Figura 6 Suplementar). O ajuste irá gerar um ajuste à função de resposta do instrumento usando a primeira e a segunda derivadas de um Gaussian. Clique no botão Salvar e, em seguida, clique em x para fechar a tela.
    NOTA: A linha ajustada vermelha deve corresponder bem aos pontos de dados (quadrados ocos azuis) em todo o intervalo de tempo, mais importante o recurso grande visto perto do tempo zero (0,1-2,0 ps). O ajuste terá mais sucesso se houver um alto número de pontos em torno do tempo zero, o que pode ser alcançado usando uma janela de atraso de tempo curta para o experimento "em branco" e retendo um grande número de pontos. Se o ajuste não parecer corresponder bem aos pontos de dados, marque a caixa "Adicionar Gaussiano (R0)" e tente novamente o ajuste. Esta opção adicionará uma soma do Gaussiano à primeira e segunda derivadas e poderá se ajustar melhor à forma do recurso IRF neste comprimento de onda. Se o encaixe de resposta do solvente ainda não conseguir capturar o sinal IRF, selecione um comprimento de onda diferente.
12. Execute esse processo (etapas 1.10-1.11) pelo menos cinco vezes, pois cinco pontos serão necessários para corrigir corretamente um chirp. Os pontos devem ser espaçados por toda a janela espectral, se possível. Alguns solventes/substratos podem não gerar um sinal observável em porções da janela espectral, dependendo das condições experimentais. Mais pontos podem ser adicionados/usados conforme necessário para produzir um ajuste aceitável. Quando concluído, feche o conjunto de dados "em branco".
    Observação : cada ponto salvo é gravado em um arquivo do Excel na pasta de trabalho como uma nova linha assim que o usuário clica em Salvar. Se um ponto indesejado for salvo, o ponto poderá ser removido do arquivo do Excel excluindo a linha do ponto indesejado.
13. Reabra o conjunto de dados cortado e subtraído em segundo plano. Clique no menu Surface e, em seguida, clique na opção Chirp Correction . Isso abrirá uma nova tela com três janelas e um menu no canto inferior direito (Figura 7 Suplementar).
14. Adicione a correção de chirp que acabou de ser criada. Clique na opção Adicionar do arquivo , selecione o arquivo do Excel que termina em "ajustar coeficientes" e clique em OK. O ajuste de correção de chirp agora é exibido na janela superior esquerda como uma linha preta com marcadores X (Figura 8 suplementar).
    Observação : a correção de chirp é exibida como uma linha sólida; os marcadores X ao longo da linha são os pontos gerados a partir do processo de resposta ao solvente de ajuste. Os pontos podem ser adicionados manualmente ajustando a mira e clicando em Adicionar. Os pontos também podem ser removidos destacando-os e pressionando Remover. Outros pontos podem ser editados manualmente digitando valores na lista no canto inferior direito. Finalmente, se desejado, a correção atual também pode ser salva como um arquivo para reutilização posterior usando o botão Salvar em arquivo .
15. Clique no botão Visualizar correção de chirp . Isso aplica temporariamente a correção de chirp. Observe a correção na janela superior esquerda para garantir que os dados foram temporariamente achatados e nenhuma curvatura mais é observável.
    1. Se estiver satisfeito com a correção de chirp, clique no botão Apply & Sair . Se não estiver satisfeito, repita os passos 1.10-1.14, escolhendo mais (ou diferentes) comprimentos de onda para o ajuste de correção do chirp até que uma correção satisfatória seja obtida.
       NOTA: A aplicação da correção de chirp ajustará o tempo zero para a linha reta como aparece na visualização. Pode haver algum desalinhamento temporal entre o "branco" e a superfície de dados.
16. Clique no menu Arquivo e, em seguida, clique em Salvar arquivo como. Digite um nome apropriado para o arquivo para indicar que uma correção de chirp foi aplicada. Em seguida, clique em OK.
17. Alguns recursos de dispersão nos dados podem não ser completamente removidos ao executar a subtração em segundo plano. Essas características impactam o ajuste e produzem resultados errôneos de ajuste. Localize esses recursos nos dados que devem ser removidos. A característica de espalhamento pode ser mais facilmente identificada na região de tempo negativo.
    1. No bloco do mapa de calor superior esquerdo, clique e arraste a mira para a região de tempo negativa. Permanecendo dentro da região de tempo negativo, use a mira para determinar os comprimentos de onda em que o recurso de espalhamento começa e termina. Observe o intervalo de comprimento de onda do recurso de dispersão (para o conjunto de dados fornecido, o intervalo de recursos é de 654 nm a 672 nm).
       NOTA: Ao determinar se um recurso deve ser removido, arraste a mira horizontal para cima e para baixo através dos eixos de tempo para visualizar o intervalo espectral do recurso. As características de espalhamento normalmente têm traços cinéticos de comprimento de onda único muito barulhentos, de modo que a faixa espectral da característica também pode ser verificada usando os traços cinéticos.
18. Começando com o comprimento de onda inferior (azul) (ou seja, 654 nm), clique no comprimento de onda da extremidade direita no espectro (bloco inferior esquerdo) e digite o valor da extensão de feição inferior (azul).
19. Recorte os dados clicando no menu Surface e, em seguida, clique em Recortar. Clique em OK no menu pop-up. Salve os dados cortados com um nome de arquivo exclusivo para indicar de que lado dos dados isso está (Azul ou Esquerda é recomendado). Feche o arquivo.
20. Abra o arquivo com a correção de chirp aplicada salva na etapa 1.16. Continue até a extensão de comprimento de onda mais alta (vermelho) do recurso. Clique no comprimento de onda da extremidade esquerda no espectro (bloco inferior esquerdo) e digite o valor da extensão mais alta do recurso.
21. Recorte os dados clicando no menu Surface e, em seguida, clique em Recortar. Clique em OK no menu pop-up. Salve os dados cortados com um nome de arquivo exclusivo para indicar de que lado dos dados isso está (Vermelho ou Direita é recomendado).
22. Combine os dois arquivos clicando no menu Arquivo e, em seguida, clique em Combinar várias superfícies. Na nova janela, selecione os dois lados dos dados (ou seja, Direito e Esquerdo ou Azul e Vermelho). Use ctrl + clique para selecionar cada arquivo. Verifique se ambos os arquivos estão selecionados na caixa "Nome do arquivo:" e, em seguida, clique em OK no canto inferior direito. Quando a barra de progresso terminar, os dados foram combinados.
    Observação : qualquer número de arquivos pode ser combinado dessa maneira. Os dados podem ser costurados em vários cortes nos eixos de tempo e comprimento de onda.
23. Clique no menu Arquivo , clique em Salvar arquivo como e escolha um nome de arquivo exclusivo para indicar que ele está combinado (Combinado ou Composto recomendado). Em seguida, clique em OK para salvar o arquivo.
    Observação : consulte a seção 3 para obter informações sobre como salvar dados da janela de dados brutos para exibição e plotagem posteriores. Os dados no mapa de calor (bloco superior esquerdo) devem aparecer como na Figura 3 e agora estão prontos para serem ajustados. A visualização dos espectros representativos, como mostra a Figura 3, é descrita na etapa 3.1.2.

2. Realizando um ajuste

1. Carregue a superfície de dados preparada corretamente.
2. Decida qual ajuste será realizado e mova para a seção apropriada.
   NOTA: Este protocolo apresenta duas opções de ajuste de dados: a etapa 2.3 apresenta o ajuste do traçado cinético de comprimento de onda único e a etapa 2.4 apresenta o ajuste da análise global.
3. Encaixe de comprimento de onda único
   1. Para configurar um único ajuste cinético, mova o cursor (nos blocos superior ou inferior esquerdo) para o comprimento de onda desejado. Clique no menu Cinética e, em seguida, clique em Ajustar Cinética. Para o conjunto de dados fornecido, comece com 632 nm.
   2. Na nova janela que se abre (Figura Suplementar 9), observe que os principais parâmetros de ajuste e valores de semente estão definidos no canto superior esquerdo da janela, abaixo do logotipo do programa, na caixa ao lado dessa área sob o texto "ajuste atual @ comprimento de onda".
   3. Clique nos botões de seta para ajustar o número de vidas (ou seja, o número de decaimentos exponenciais usados para ajustar os dados) na caixa "Tempos de vida finitos". Para o conjunto de dados fornecido, escolha 2 tempos de vida. Uma a 3 vidas são típicas como ponto de partida.
   4. Se o sinal de dados se estender além da janela de tempo coletada, um componente de vida útil "infinito" deve ser incluído. Para fazer isso, clique na caixa de seleção Usar tempo de vida infinito . Se os dados decaírem totalmente para a linha de base, não marque essa caixa. Para o conjunto de dados fornecido, não marque a caixa.
      NOTA: A "vida útil infinita" permite que um deslocamento de sinal permaneça (ou seja, o programa não forçará o ajuste a decair de volta à linha de base). O uso de um componente infinito é necessário quando o sinal nesse comprimento de onda não decai para a linha de base dentro do intervalo de tempo do experimento.
   5. Insira valores de adivinhação para o tempo de vida e amplitudes associadas, tempo de resposta do instrumento e tempo zero para ajudar no processo de ajuste (Figura 10 Suplementar). Clique no parâmetro desejado. Clique na janela de valor, digite um valor de adivinhação e clique no botão de adivinhação inicial para definir o valor. Para o conjunto de dados fornecido, os valores de palpite apropriados são: 0 = 0 ps, IRF = 0,25 ps, A1 = 0,6, t1 = 100 ps, A2 = 0,08, t2 = 1100 ps.
      NOTA: "0" é a estimativa do tempo zero, "IRF" é o tempo de resposta do instrumento, "A" refere-se à amplitude de um dado exponencial (ver Equação 3), e "t" é a constante de tempo de vida/tempo. Fornecer bons valores de palpite ajuda o programa a obter um ajuste razoável. Escolha valores "A" que estejam dentro dos valores do intervalo A no conjunto de dados. Escolha valores de "t" em intervalos de tempo onde se observa mudança significativa no traçado cinético. A melhor maneira de obter intuição sobre como os valores de palpite afetam o ajuste é tentar vários conjuntos de valores de palpite e observar os ajustes que eles produzem. Se um ou mais desses parâmetros forem conhecidos, esse parâmetro pode ser definido e "fixado" para que não varie com o ajuste (Figura 11 Suplementar).
   6. Quando todos os parâmetros de adivinhação forem inseridos, clique no botão Ajustar . Um ajuste representativo é mostrado na Figura 4.
      NOTA: A aplicação do ajuste preencherá o gráfico de dados com a linha de ajuste e um gráfico residual que pode ser usado para avaliar a qualidade do ajuste. Os parâmetros de ajuste, como o tempo de vida e as amplitudes associadas, o tempo zero e o tempo de resposta do instrumento, também são preenchidos na caixa superior esquerda. Use vários parâmetros de ajuste diferentes para determinar o número de tempos de vida e a inclusão/exclusão de um componente de tempo "infinito" que produza o melhor ajuste aos dados.
   7. Salve o ajuste clicando no botão Salvar (Figura 9 suplementar).
      Observação : consulte a seção 3 para obter informações sobre como salvar dados da janela de dados brutos para exibição e plotagem posteriores.
4. Ajuste de análise global
   1. Clique no menu Surface e, em seguida, clique na opção Componentes principais via SVD . Uma nova janela é exibida (Figura 12 suplementar).
      Observação : a janela superior direita exibe os traços cinéticos principais e a parte inferior esquerda exibe os espectros principais. O bloco superior esquerdo exibe um gráfico da superfície residual criada pela diferença entre a superfície original e uma superfície criada pelos componentes principais selecionados.
   2. Clique nos botões de seta para definir o "Número de componentes principais" (Figura suplementar 12). Para o conjunto de dados fornecido, escolha 15.
      NOTA: Ao decidir sobre o número de componentes principais a escolher, uma maneira é continuar aumentando o número até que os espectros principais e os traços cinéticos principais se assemelhem a um padrão de ruído. Outra maneira de determinar quantos componentes principais escolher é observando os valores de coeficiente de peso que aparecem à esquerda da legenda no bloco superior direito. Continue adicionando componentes principais até que esse valor atinja 0,01. Geralmente, é aconselhável adicionar mais alguns além disso para uma boa medida. Isso pode resultar na seleção de até 15 ou mais componentes principais.
   3. Clique no botão Salvar . Os componentes principais salvos são necessários para avançar para a próxima etapa.
      Observação : cada componente principal é uma representação de complexidade reduzida da superfície de dados original. O uso de componentes principais resultará em uma superfície simplificada em comparação com os dados brutos que estão sendo analisados. Contabilizar a maioria dos principais recursos da superfície de dados é muito importante para obter um ajuste preciso, por isso é fundamental usar componentes principais suficientes para capturar esses recursos. O uso de mais componentes principais não comprometerá o ajuste. Portanto, se houver alguma dúvida sobre quantos componentes principais selecionar, use mais componentes principais em vez de menos. Lembre-se de que o uso de muitos pode tornar o software de ajuste mais lento.
   4. Depois de salvar os componentes principais, o programa retornará à tela principal e o ajuste global agora pode ser tentado. Clique no menu Surface e, em seguida, clique na opção Ajuste Global . Uma nova janela será aberta (Figura 13 Suplementar).
      Observação : traços cinéticos principais são exibidos no bloco superior direito. O bloco superior esquerdo exibirá uma superfície da superfície de ajuste em comparação com a superfície bruta. O bloco inferior esquerdo exibirá os espectros de diferença associados ao decaimento (DADS) gerados pelo ajuste. Finalmente, o bloco inferior direito é onde os parâmetros de ajuste podem ser definidos, incluindo o número de funções exponenciais a serem usadas e se uma função infinita deve ser usada.
   5. Use os botões de seta ao lado do "número de exp." para definir o número de funções exponenciais a serem incluídas no ajuste. Se o sinal de dados se estender além da janela de tempo coletada, um componente de vida útil "infinito" deve ser incluído. Para fazer isso, clique na caixa de seleção Usar deslocamento (Ainf). Para o conjunto de dados fornecido, escolha 2 e não clique na caixa. Se os dados decaírem totalmente para a linha de base, não marque essa caixa.
      NOTA: Os parâmetros de ajuste podem ser corrigidos antes de executar um ajuste clicando na coluna do rótulo na caixa inferior direita sob coeficientes de ajuste globais. O rótulo ficará vermelho e mudará para ter um indicador (fixo) no rótulo. Qualquer valor digitado na caixa à direita será usado para esse parâmetro, em vez de livremente variado para o ajuste. Deve-se ter cuidado ao fixar valores para um ajuste, pois isso pode enviesar os resultados do ajuste.
   6. Clique no botão Ajustar . O progresso do ajuste será exibido através de uma pequena barra de carregamento no centro da tela. Após a conclusão do progresso do ajuste, as janelas serão preenchidas com os dados do ajuste (Figura 5 e Figura 14 Suplementar). Examine visualmente os resultados do ajuste.
      NOTA: As informações do ajuste cinético principal e do DADS são usadas para determinar se o ajuste vale a pena salvar ou se é muito ruim. Geralmente, se o ajuste dos traços principais coincidir bem com os dados, e houver nenhuma ou muito poucas características no gráfico, o ajuste pode ser aceito. É fácil verificar vários ajustes alterando o número de vidas e/ou marcando/desmarcando o botão "Usar deslocamento (Ainf)". O melhor ajuste produzido após a verificação de múltiplas variações dos parâmetros de ajuste deve ser aceito.
   7. Clique no botão Salvar . Isso salvará o ajuste mostrado atualmente junto com os dados em um arquivo do Excel.
      Observação : O arquivo do Excel é salvo no mesmo local de arquivo que o conjunto de dados. Se ajustes adicionais forem realizados e precisarem ser salvos, eles substituirão qualquer versão anterior. Como tal, antes de gerar e salvar um novo ajuste, dê a qualquer ajuste antigo um nome exclusivo. Os parâmetros salvos do ajuste incluem apenas o tempo zero, IRF, tempos de vida e seus DADS acompanhantes. Este arquivo não contém nenhuma informação sobre o gráfico ou o ajuste aos traços cinéticos principais. O salvamento dos principais traços cinéticos é descrito na etapa 3.3. Consulte a etapa 3.0 para obter informações sobre como salvar dados da janela de dados brutos para exibição e plotagem posteriores.

3. Extração de dados brutos e ajustes do software de ajuste para plotagem

NOTA: Dados brutos ou ajustes produzidos a partir de ajuste de comprimento de onda único ou análise global podem ser exportados para arquivos csv que podem ser abertos em uma variedade de outros programas.

1. Extraindo dados brutos para plotagem
   1. Para exportar o mapa de calor do conjunto de dados, clique no menu Arquivo e, em seguida, clique em Exportar para CSV (Figura Suplementar 15). Isso abrirá uma janela, clique em OK para salvar o arquivo csv no mesmo diretório que o arquivo de dados aberto com o mesmo nome do arquivo de dados.
      NOTA: Como alternativa, os dados brutos podem ser exportados clicando com o botão direito do mouse na janela do mapa de calor e clicando em Exportar dados para a área de transferência. Isso salvará temporariamente os dados para que possam ser colados em um documento de software de escolha do usuário. Cole os dados em um arquivo do Excel e salve-os.
   2. Vários espectros podem ser exibidos na janela para comparação ou para fins de criação de uma figura. Arraste o cursor horizontal (no mapa de calor, canto superior esquerdo) para um ponto de tempo desejado. Pressione Ctrl + S para selecionar o espectro e salvá-lo na janela espectral (canto inferior esquerdo). Adicione quantos pontos de tempo forem necessários para mostrar a progressão dos dados (5-10 espectros), como pode ser visto na Figura 3.
      NOTA: O número de espectros escolhidos para representar os dados e a disposição temporal destes espectros podem depender fortemente da amostra específica e das condições experimentais. A recomendação acima é uma diretriz geral, mas as especificidades do experimento devem ditar quais partes do conjunto de dados são enfatizadas.
   3. Exporte como dados clicando com o botão direito do mouse na janela que contém os espectros. Clique na opção Exportar dados para a área de transferência . Os dados são salvos temporariamente. Cole esses dados no documento de software desejado (ou seja, Excel) e Salvar.
   4. Múltiplos traços cinéticos podem ser exibidos na janela cinética da mesma maneira que a janela de espectros. Arraste o cursor vertical (no mapa de calor, canto superior esquerdo) para o comprimento de onda desejado. Pressione Ctrl + X para selecionar o rastreamento de tempo e salvá-lo na janela cinética (canto superior direito). Adicione quantos pontos de tempo desejar. Isso salvará temporariamente o rastreamento cinético atual na janela.
   5. Exporte como dados clicando com o botão direito do mouse na janela que contém os traços cinéticos. Clique na opção Exportar dados para a área de transferência . Os dados são salvos temporariamente. Cole esses dados no documento de software desejado (ou seja, Excel) e Salvar.
2. Extraindo dados de um único ajuste de comprimento de onda para exibição
   1. Clique no menu Kinetics e, em seguida, clique em Fit Kinetic para abrir a janela que contém os dados ajustados.
   2. Clique com o botão direito do mouse na janela de ajuste (ou seja, o bloco central na janela de ajuste único). Clique em Exportar dados para a área de transferência. Isso irá salvá-lo temporariamente para que ele possa ser colado em um programa de software diferente.
      Observação : o gráfico residual abaixo dos dados de ajuste não pode ser exportado e, em vez disso, terá que ser recriado a partir dos dados de ajuste. O ajuste exporta os dados brutos e a linha de ajuste, que podem ser usados para recriar o residual. O residual é criado subtraindo o valor de ajuste dos dados em cada ponto de tempo e criando um gráfico semelhante ao que é mostrado na janela "Cinética de ajuste".
   3. Cole esses dados no documento de software desejado (ou seja, Excel) e Salvar.
      Observação : exportar para a área de transferência incluirá apenas os dados brutos e os dados de linha de ajuste para cada exponencial usado no ajuste. Os parâmetros do ajuste, como vida útil, amplitudes e afins, não serão incluídos e deverão ser exportados copiando-se os valores do software de ajuste.
3. Extração de dados da análise de vida útil global para exibição e análise
   1. Clique no menu Surface e, em seguida, clique na opção Ajuste Global para abrir a janela que contém os dados ajustados.
   2. A precisão para os valores dos eixos densidade óptica e atraso de tempo/comprimento de onda precisará ser ajustada para os componentes principais (bloco superior direito) e DADS (bloco inferior esquerdo), respectivamente. Coloque o mouse sobre a janela do componente principal até que a caixa de configuração apareça no canto inferior direito.
   3. Clique rapidamente no botão x.xx , passe o mouse sobre "Precisão" e clique em 6 no menu para definir o número de casas decimais a serem incluídas.
   4. Coloque o mouse sobre a janela do componente principal até que a caixa de configuração apareça no canto inferior direito. Clique rapidamente no botão y.yy , passe o mouse sobre "Precision" e clique em 6 no menu para definir o número de casas decimais a serem incluídas.
   5. Clique com o botão direito do mouse na janela Traços cinéticos principais . Clique em Exportar dados para a área de transferência. Isso irá salvá-lo temporariamente para que ele possa ser colado em um programa de software diferente.
   6. Cole esses dados no documento de software desejado (ou seja, Excel) e Salvar.
      NOTA: Os dados serão salvos como uma série de colunas contendo primeiro os Atrasos de Tempo, depois os Rastreamentos Cinéticos Principais seguidos pela linha de ajuste. Haverá um conjunto para cada componente principal selecionado ao se preparar para a análise global. Os espectros DADS já foram guardados como parte do procedimento de montagem na etapa 2.4.7.

A preparação e análise de uma amostra de 1,4-Bis[2-(5-feniloxazolyl)]benzeno, POPOP em etanol foi realizada seguindo o procedimento descrito acima. As medições foram realizadas utilizando-se um espectrômetro de absorção transiente ultrarrápido, conforme descrito na Figura 1, com soluções fluidas em cubetas de 2 mm, utilizando-se um porta-cubetas ajustável e um agitador magnético para garantir a mistura. As amostras foram medidas em condições ambientes, sem controles adicionais de temperatura ou atmosfera. A janela óptica de 340 nm a 680 nm foi gerada usando um cristal de fluoreto de cálcio. Duzentos e cinquenta (250) pontos de tempo foram coletados entre −5 ps a ~5500 ps, e três varreduras foram calculadas em média para gerar o conjunto de dados final, Figura 3. Os dados do POPOP foram preparados conforme descrito no protocolo. Um exemplo de correção de chirp sub-ótimo é mostrado na Figura Suplementar 16. O ajuste cinético de comprimento de onda único foi realizado no POPOP, selecionando-se 632 nm como o comprimento de onda de interesse. Adicionalmente, foi realizada análise global do POPOP, conforme descrito no protocolo.

O ajuste cinético de comprimento de onda único do POPOP a 632 nm produziu duas vidas. Permitiu-se que esses tempos de vida variassem e nenhum outro ajuste foi feito. Os parâmetros finais obtidos foram: t0 = −0,1176 ps, IRF = 0,436 ps, A1 = 0,0956, t1 = 1,614 ps, A2 = 0,0646, t2 = 522,2 ps (Figura 4). Esses resultados estão em boa concordância com a análise global realizada posteriormente e com os valores relatados de tempo de vida das emissões para POPOP (τ = 1,35 ns)¹⁷. Um exemplo de ajuste de comprimento de onda único com poucos componentes de vida útil é mostrado e discutido na Figura Suplementar 16.

A adaptação da análise global do POPOP foi realizada após a seleção de 15 componentes principais (CPs) durante a realização da SVD. Dois tempos de vida foram selecionados após o ajuste, nenhum parâmetro foi fixado. Os parâmetros finais obtidos com o ajuste foram: t0 = −0,1586 ps, tp (IRF) = 0,4408 ps, t1 = 1459 ps, t2 = 267,5 ps. Os espectros de diferenças associados ao decaimento estão apresentados na Figura 5. Os resultados foram concordantes com os do ajuste cinético único a 632 nm e com os valores de tempo de vida para POPOP¹⁷. Dois exemplos de análise global subótima são mostrados e discutidos na Figura Suplementar 16.

Figura 1: Representação esquemática do instrumento de absorção transiente de banda larga femtossegundo descrito neste protocolo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Simulação de dados TAS e contribuições para o sinal TAS. (A) Curvas gaussianas simulando um espectro de absorção do estado fundamental (linha pontilhada azul) e um espectro de estado excitado (linha pontilhada vermelha, deslocada para o vermelho do espectro do estado fundamental). O espectro de diferença desses dois espectros (roxo, linha sólida) é o espectro de diferença visto em TA. As diferenças entre os espectros terrestre e de estado excitado foram exageradas para fins ilustrativos. (B) Um espectro representativo de diferença TA do POPOP em 1,04 ps após excitação em 330 nm. As linhas pontilhadas mostram a absorvância do estado fundamental e a emissão em estado estacionário de POPOP. As regiões destacadas mostram características comuns de AT, água sanitária no estado do solo (GSB), emissão estimulada (SE) e absorbância no estado excitado (ESA) observadas nesses dados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Dados preparados para POPOP que resultam da aplicação da etapa 1 - Preparação dos dados. Os dados são apresentados como mapa de calor corrigido e espectros representativos. Esses resultados demonstram como os dados devem ficar após as correções terem sido aplicadas e um está pronto para aplicar um ajuste ao conjunto de dados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Resultados do ajuste de comprimento de onda único do POPOP a 632 nm após a aplicação do passo 2.3 - Ajuste de comprimento de onda único. A figura mostra (seção superior) os tempos de vida obtidos em formato de tabela, (seção do meio) os dados (pontos azuis) e o ajuste aos dados (linha de ajuste vermelha), e (seção inferior) o gráfico residual. Observe que na seção "ajuste atual", as amplitudes (A) são mostradas como os valores de ΔA dos dados que representam a contribuição daquele componente específico do tempo de vida em t0. No entanto, quando o ajuste atual é salvo e aparece na tabela "Coeficientes de ajuste", a configuração padrão é mostrar as amplitudes normalizadas. Essa configuração pode ser alterada desmarcando a caixa ao lado do rótulo "Coeficientes de ajuste" "Normalizado". Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Resultados da análise global do ajuste do POPOP obtidos após a etapa 2.4 de adaptação. Clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 6: Exemplo de espalhamento Raman estimulado observado em dados experimentais de AT. Neste conjunto de dados (não os dados POPOP mostrados no tutorial), a amostra foi excitada a 550 nm (indicada pela linha pontilhada). O espalhamento Raman é visto por volta do tempo zero e geralmente aparece tanto para o azul (espalhamento Raman anti-Stokes) quanto para o vermelho (espalhamento Raman de Stokes) do comprimento de onda de excitação da bomba. O espalhamento Raman estimulado é de curta duração, tipicamente apenas em torno de ~200 fs, porque ocorre como resultado da interação do feixe de sonda com a amostra ao mesmo tempo que o feixe de bomba, estimulando assim o processo Raman. No entanto, o recurso não pode ser evitado e deve ser removido com o corte. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura suplementar 1: Menu principal quando os dados são inicialmente carregados. Geralmente, neste software de encaixe haverá caixas de opção que aparecem no canto inferior direito de uma janela quando a janela é cortada. Essas caixas permitem alterar a interação do cursor com a janela, movendo seleções, ampliando ou movendo as janelas selecionadas. Há também opções para ajustar a precisão das escalas dos eixos x e y para a janela, bem como mudar a exibição de linear para logarítmica. Os eixos também podem ser bloqueados ou desbloqueados. Enquanto estiver bloqueado, um eixo permanecerá no nível de zoom ou no intervalo de valores especificado; Quando desbloqueado, o intervalo alternará para conter o conjunto completo de dados. Outras opções permitem ajustar a exibição de números e a coloração de grades, se presentes. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura suplementar 2: Menu de superfície para realizar a subtração da luz espalhada. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura 3 suplementar: Subtrair tela de luz espalhada - definindo os espectros para média. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura suplementar 4: Configuração do intervalo de recorte. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura suplementar 5: Conjunto de dados de recorte. Os dados cortados serão removidos permanentemente. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura 6 suplementar: Ajustar a janela de resposta ao solvente e o exemplo de ajuste da resposta ao solvente (na linha vermelha) aos dados (pontos azuis). Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura 7 suplementar: Janela de correção de chirp com dados de amostra "em branco". Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura 8 suplementar: Correção de chirp mostrada junto com o conjunto de dados. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura Suplementar 9: Janela Single Kinetic Fit. Além disso, um controle deslizante na parte superior permite que o usuário selecione o comprimento de onda no qual executar o ajuste. A seleção de um comprimento de onda apropriado requer conhecimento da espectroscopia do sistema para identificar onde os processos de interesse ocorrem. Exemplos incluem produtos de transferência de carga, formação de trigêmeos ou formação de fotoprodutos, cujas características espectrais são conhecidas por se correlacionarem com comprimentos de onda específicos. Esses comprimentos de onda específicos podem ser ajustados para obter a vida útil desses eventos específicos. Além disso, uma seleção de comprimentos de onda pode ser usada para fornecer validação a um modelo de ajuste global selecionado. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura suplementar 10: Definindo parâmetros de ajuste cinético único. Os parâmetros de ajuste individuais podem ser fixados ou alterados manualmente, se desejado, para ajustar o ajuste e minimizar o desvio padrão do resíduo. Nota: Os parâmetros podem ser facilmente ajustados clicando no valor na caixa e, em seguida, ajustando usando um controle deslizante ou digitando manualmente um valor. O ajuste exibido será ajustado em tempo real à medida que os valores forem alterados. Quando um ajuste aceitável é alcançado, o ajuste pode ser exportado clicando com o botão direito do mouse na tela de ajuste, o que permite exportar os dados para a área de transferência para colar em um programa desejado ou como uma imagem para visualização rápida. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura Suplementar 11: Restringir e fixar valores de parâmetros de Ajuste Cinético Único pode ser feito se um ou mais parâmetros forem bem conhecidos. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura suplementar 12: Janela Decomposição de valor único com componentes principais mostrando como o rastreamento e os componentes ficarão quando componentes principais suficientes forem adicionados. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura suplementar 13: Janela de ajuste global antes que o ajuste da análise global seja gerado. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura suplementar 14: Janela Global Fit mostrando os resultados do ajuste da análise global. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura suplementar 15: Menu Arquivo para salvar e exportar arquivos. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura suplementar 16: Exemplos de correção e ajuste de chirp subótimos. (A) demonstra um ajuste cinético único pobre. O tipo de resíduo estruturado mostrado no painel A normalmente indica que um tempo de vida adicional é necessário para ajustar os dados. Observe que o residual cai abaixo de zero em tempos mais curtos e é elevado acima da linha zero em vidas mais longas. (B) demonstra uma correção correta do chirp usando o botão de visualização, no qual os recursos são endireitados e nenhuma curvatura está presente nos dados. (C) demonstra uma correção incorreta do chirp em que há uma curvatura perceptível presente na porção azul do espectro, indicando que a função chirp está supercorrigindo nessa região. (D) exibe um ajuste de análise de vida global ruim no qual o sobreajuste (incluindo muitos parâmetros) resultou em DADS "simétricos" (que se parecem com imagens espelhadas uns dos outros no eixo x) de intervalos de vida semelhantes que essencialmente se anulam. Quando essas características são observadas, o ajuste não deve ser usado. (E) exibe um ajuste global pobre em que muitos parâmetros resultaram em uma vida útil muito curta com uma amplitude muito grande. O problema presente em (E) também pode aparecer se artefatos em torno do tempo zero não forem devidamente corrigidos e o ajuste se concentrar em minimizar o resíduo, superenfatizando o tempo de vida muito curto (que não é fisicamente significativo). Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura suplementar 17: Exemplo de dados TAS com espalhamento Raman. O espalhamento está presente em torno do tempo zero e coincide com o comprimento de onda de excitação da bomba. O espalhamento consiste em uma série de picos agudos com um pico positivo muito intenso azul da excitação da bomba e um pico negativo vermelho da excitação da bomba. Esse recurso não pode ser evitado razoavelmente e deve ser cortado dos dados para evitar interferir nos resultados do ajuste. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo suplementar 1: arquivo que contém o conjunto de dados para este tutorial (POPOP data_POPOP-inEtOH.ufs). Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo suplementar 2: arquivo que contém um conjunto de dados em branco para este tutorial (POPOP data_BLANK.ufs). Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo Suplementar 3: Arquivos de Informações de Suporte contendo comentários adicionais sobre a resposta do solvente de ajuste, correção de dispersão e subtração de superfícies. Clique aqui para baixar este arquivo.

Considerações gerais para a preparação de dados
O ajuste dos dados de AT pode parecer, à primeira vista, relativamente simples, e pode-se esperar que uma "resposta" correta clara resulte para um determinado conjunto de dados. No entanto, como destacado no protocolo, há muitos fatores na aquisição, preparação de dados e análise de dados a serem cuidadosamente considerados que podem levar à incerteza sobre qual modelo ou conjunto de parâmetros de ajuste melhor descreve os dados. O objetivo da preparação e ajuste dos dados é reduzir o maior número possível desses fatores estranhos, preservando os dados para análise. A tarefa em questão pode parecer assustadora para um iniciante, pois há muito a considerar. Para criar intuição sobre o processo de ajuste, o iniciante é encorajado a tentar preparar os mesmos dados várias vezes do zero de maneiras ligeiramente diferentes para verificar o quão dramaticamente as etapas de preparação de dados afetam o melhor ajuste. Além disso, dois pesquisadores diferentes podem preparar e ajustar os mesmos dados e comparar resultados. Esse processo pode ser demorado nas primeiras vezes, no entanto, isso permitirá que o iniciante desenvolva intuição sobre como preparar consistentemente os dados para amostras futuras. Como qualquer habilidade, essa preparação e adaptação de dados levará tempo para se desenvolver, e o iniciante é encorajado a ser paciente e disciplinado ao experimentar e aprender o processo. O conjunto de dados usado neste estudo é fornecido para dar ao iniciante a chance de se encaixar diretamente ao lado do tutorial e comparar diretamente os resultados com os produzidos no tutorial.

Os dados podem conter características de fundo que estão presentes em todos os atrasos de tempo (Figura 2 Suplementar e Figura 3 Suplementar), como espalhamento do feixe da bomba e emissão espontânea da amostra. Essas características indesejadas devem ser removidas para isolar o sinal de absorção transitória da espécie de interesse¹¹. A remoção de tais características é feita escolhendo, calculando a média e removendo a contribuição de um número de espectros de diferença de tempo negativos. Ao selecionar espectros de fundo, é importante garantir que nenhum recurso que possa fazer parte do processo de interesse seja incluído para remoção. Características de fundo decorrentes do solvente, como a absorção de impurezas ou do próprio solvente, também podem ser observadas nos dados de AT. Quando o solvente produz um sinal, um conjunto de dados "em branco" contendo apenas o solvente executado sob as mesmas condições experimentais que a amostra precisará ser subtraído do conjunto de dados da amostra. Detalhes sobre este procedimento estão incluídos no Arquivo Suplementar 3.

A correção do chirp é outro fator a ser considerado com cuidado. O chirp ocorre quando o pulso da sonda viaja até a amostra e se amplia devido a imperfeições nos espelhos de direção ou ao passar por ópticas dispersivas, como lentes ou filtros. O resultado final é que fótons de energia mais baixa no pulso da sonda (ou seja, o lado vermelho do espectro da sonda) chegam à amostra antes de fótons de energia mais alta (ou seja, o lado azul do espectro da sonda). Isso resulta no "tempo zero" dos espectros de TA sendo espalhados ao longo de vários femtosegundos ou picossegundos¹⁸, que se manifesta como uma curva distinta no conjunto de dados brutos começando nos comprimentos de onda azuis e depois se achatando à medida que se aproxima do vermelho (Figura Suplementar 7). Chirp é mais perceptível em escalas de tempo mais curtas, como aquelas acessadas por TA ultrarrápido. Esse tempo zero dependente do comprimento de onda pode ser corrigido conforme descrito no protocolo, mas a aplicação desse processo pode ser complicada e subjetiva. Ter uma amostra "em branco" ou a medição da resposta Kerr do solvente pode minimizar a natureza subjetiva dos pontos de seleção manual para a correção de chirp necessária para gerar o ajuste polinomial usado para ajustar e corrigir o chirp. O objetivo da correção de chirp é remover a distinta "curva" do tempo zero. Pode levar várias tentativas de ajustar o chirp para obter os melhores dados corrigidos pelo chirp. Os dados podem ser ajustados várias vezes com diferentes correções de chirp aplicadas a fim de obter uma compreensão do impacto que a correção de chirp tem sobre os valores dos curtos tempos de vida do TA.

Artefatos que aparecem no "tempo zero"
Vários artefatos podem ser observados próximos ao "tempo zero" nos dados de AT, incluindo espalhamento de Rayleigh, espalhamento Raman estimulado e modulação de fase cruzada. O espalhamento Rayleigh do feixe da bomba é um espalhamento elástico que resulta sem uma mudança na energia. Esse recurso aparecerá no mesmo comprimento de onda que o pulso da bomba. O espalhamento Raman estimulado pode acompanhar o sinal de espalhamento da bomba¹⁹. O espalhamento Raman, que resulta do espalhamento inelástico de um fóton de bomba, produz picos de energia mais alta (anti-Stokes) e mais baixa (Stokes) do que a energia da bomba incidente. Nos dados de AT, observa-se espalhamento Raman estimulado devido à irradiação simultânea da amostra com os feixes da bomba e da sonda. Quando o feixe de sonda interage com a amostra ao mesmo tempo que o feixe de bomba, ele estimula o processo Raman. Portanto, o espalhamento Raman estimulado ocorre em torno do tempo zero e resulta em picos adicionais nos espectros dentro das primeiras centenas de femtosegundos (Figura 6, observada no espectro azul mais escuro na região destacada e Figura 17 suplementar). A modulação de fase cruzada origina-se da modulação do índice de refração do solvente a partir da interação com o campo elétrico intenso de um pulso.

O espalhamento Raman estimulado pode ser distinguido da modulação de fase cruzada porque os picos Raman aparecem em frequências específicas que correspondem aos modos vibracionais do solvente. Por se tratar de um processo Raman, tanto as linhas de Stokes quanto as anti-Stokes em ambos os lados da excitação podem ser observadas. Solventes clorados como o cloreto de metileno apresentam bandas Raman muito proeminentes devido à grande polarizabilidade do cloro. As assinaturas espectrais da modulação de fase cruzada são exclusivas de um solvente, mas não são tão facilmente previstas quanto as características de espalhamento Raman.

Dependendo da cinética da amostra que está sendo medida, o espalhamento de Rayleigh, o espalhamento Raman e a modulação de fase cruzada podem se sobrepor às características iniciais dos dados de TA e podem ser difíceis de remover dos dados. Em princípio, essas características podem ser vistas em uma medição de solvente puro e subtraídas dos dados, os programas de análise de dados podem ter funções de ajuste para dar conta dessas características, mas na prática, isso pode ser difícil. Quando é muito difícil subtrair esses artefatos sem comprometer os dados da amostra, pode ser melhor cortar os espectros comprometidos por volta do tempo zero para eliminar os artefatos. Fazer isso terá o infeliz efeito colateral de remover os primeiros aproximadamente 300 fs de dados, mas tornará o ajuste mais confiável mais tarde. Ao longo da análise de vários conjuntos de dados das mesmas amostras e de amostras diferentes, o iniciante ganhará intuição ao alcançar esse equilíbrio de subtrair a superfície de fundo versus cortar os dados iniciais de 100-200 fs.

O corte geral pode ser necessário para partes dos espectros que contêm baixo sinal-ruído. A instabilidade no feixe de sonda em certas regiões, a baixa intensidade da luz da sonda, as concentrações da amostra muito altas (bloqueando assim grande parte da sonda incidente), a baixa intensidade da bomba e a seção transversal de absorção da amostra são culpados típicos do baixo sinal-ruído que pode tornar o ajuste de dados desafiador. Nesses casos, cortar o conjunto de dados em ambos os lados da janela óptica para atingir um nível desejado de sinal-ruído pode ajudar o processo de ajuste.

Um conjunto de dados está pronto para análise depois de ter sido cortado o suficiente para remover seções pobres do conjunto de dados, ter o chirp corrigido e ter espectros de fundo medidos e subtraídos. Esse procedimento deve resultar em dados que contenham apenas as porções mais relevantes para a fotofísica e fotoquímica de interesse. De fato, é claro que há algum grau de subjetividade nesse processo. O objetivo na preparação de dados é encontrar um equilíbrio de remoção de artefatos para que eles não perturbem o ajuste, mas não para remover tanto que comprometa a integridade do conjunto de dados, dificultando assim sua interpretação. Encontrar esse equilíbrio leva tempo e experiência para construir a intuição do que é um artefato e do que são dados. Ajustar (e reajustar) o mesmo conjunto de dados em vários dias diferentes, ou fazer com que dois pesquisadores ajustem os mesmos dados, pode ser uma maneira de minimizar o erro humano e a subjetividade da preparação e análise dos dados.

Considerações gerais para adaptação e interpretação
Após o processamento dos espectros brutos de AT, eles devem ser interpretados e modelados para extrair informações sobre as espécies e a dinâmica presente no sistema de interesse. Esse processo pode ser descrito como um procedimento de três etapas que inclui interpretação espectral inicial, modelagem/ajuste quantitativo e atribuição da interpretação espectral ao modelo/ajuste.

Interpretação Espectral Inicial: Na etapa de interpretação espectral, o objetivo é atribuir características presentes nos espectros de TA a estados eletrônicos acessados na evolução fotofísica ou fotoquímica do sistema. Para começar, vários estados devem ser identificados. Neste trabalho, estados referem-se a estados eletrônicos únicos que fazem parte da evolução fotofísica ou fotoquímica do sistema. Um estado, representado, por exemplo, por uma curva de energia potencial específica (PEC), possui um conjunto de picos característicos que representam seu espectro de absorção. Uma alteração que ocorre dentro de um único estado é chamada de processo. Um processo fotofísico pode aparecer nos espectros TA como um deslocamento de pico ou uma mudança na largura do espectro. O aspecto fundamental de um processo é que a população do estado permanece a mesma (ou seja, o processo ocorre dentro de uma determinada PEC); é a distribuição de energia dentro do estado que muda. Uma mudança na população de um estado será chamada de transição. Durante uma transição, o sistema evolui para outra PEC (ou seja, estado eletrônico). As transições podem incluir conversão interna (CI), cruzamento entre sistemas (ISC), transferência de carga, transferência de energia, formação de novos produtos ou retorno ao estado fundamental. As diretrizes para atribuir estados, processos e transições são discutidas nos parágrafos a seguir.

Atribuindo estados
O primeiro passo nesse processo envolve a atribuição de características espectrais a espécies ou estados químicos específicos. O estado S₁ no TA deve mostrar um tempo de vida que corresponda ao tempo de vida da fluorescência tomado usando espectroscopia de emissão resolvida no tempo. Um estado triplete pode ser verificado se sua vida útil é extinta pelo oxigênio. Se um ânion ou cátion radical é suspeito na evolução fotofísica, espectroeletroquímica ou oxidação/redução química pode ser realizada para gerar a espécie radical, e um espectro de absorção dessa espécie pode ser obtido e comparado com a forma da banda TA. A espectroscopia de ressonância magnética eletrônica (VHS) pode ser realizada para verificar a presença de radicais livres. Uma excelente palestra tutorial organizada pela Divisão de Química Inorgânica da ACS dá uma visão geral da AT e tais considerações na atribuição de recursos²⁰. Depois que as bandas foram atribuídas às espécies, o próximo passo na interpretação dos espectros TA é descrever qualitativamente os processos dinâmicos que ocorrem no sistema. Essa etapa é vital, pois dá ao pesquisador uma ideia de quais modelos serão apropriados para descrever seu sistema e lhe dará uma linha de base para comparar os parâmetros de ajuste.

Alterações dentro de um estado
Resfriamento vibracional, rearranjo geométrico ou solvatação são processos extremamente rápidos (sub-ps a 10's ps) que podem ser observados com AT. O resfriamento vibracional é observado como um rápido deslocamento para o azul do espectro do TA em uma escala de tempo de vários picossegundos 21,22,23. O rearranjo geométrico pode ocorrer na escala de tempo de 10 ps. A dinâmica de solvatação é observada como um desvio para o vermelho e estreitamento do espectro ao longo de vários picossegundos em líquidos dipolares convencionais, mas solventes de alta viscosidade como glicerol, polietilenoglicol (PEG), líquidos iônicos e solventes eutéticos profundos podem exibir dinâmica de solvatação que ocorre ao longo de múltiplos nanossegundos 24,25,26.

Mudanças na população de um estado
As reações são caracterizadas por uma mudança na intensidade de uma banda, onde uma diminuição na intensidade está associada a uma diminuição na concentração de sua espécie química e vice-versa para um aumento. Em alguns casos, tanto a espécie reagente quanto a espécie produto são visíveis nos espectros, enquanto em outros, os estados do produto são muito curtos ou muito deslocados para o vermelho para serem observados. Muitas vezes, transições estado-estado podem ser observadas pela presença de um ponto isosbestico nos espectros.

Modelagem/Ajuste Quantitativo: Um modelo deve então ser ajustado aos dados para extrair informações quantitativas sobre a dinâmica do sistema. Como descrito anteriormente na introdução, há uma vasta gama de modelos a serem usados. Este protocolo concentra-se em dois dos métodos mais comuns: ajuste de comprimento de onda único e análise global. O método de comprimento de onda único envolve o ajuste de traços individuais de comprimento de onda dos espectros para alguma forma funcional, tipicamente uma soma de exponenciais:

(2)

onde ΔA(t) é o sinal TA em um comprimento de onda escolhido, n é o número de componentes exponenciais, e a_ié a amplitude da componente exponencial, i, com a constante de tempo τ_i. Vários componentes podem ser adicionados até que o ajuste reproduza os dados experimentais. O objetivo de qualquer processo de ajuste é modelar os dados usando tempos de vida suficientes para reproduzir bem os dados, mas não sobreajustar os dados incluindo muitos componentes. Assim, parâmetros ponderados de bondade de ajuste, como , são usados para ajudar a determinar quando os dados estão ajustados às incertezas experimentais⁵.

Após o ajuste satisfatório do decaimento, os parâmetros do modelo podem ser utilizados para caracterizar a dinâmica do sistema. As constantes de tempo resultantes podem então ser extraídas e interpretadas. Infelizmente, o grande número de características sobrepostas nos espectros TA significa que um único comprimento de onda no espectro pode conter dinâmicas correspondentes a diferentes espécies cujas assinaturas espectrais se sobrepõem, o que significa que as constantes de tempo extraídas de um único ajuste de comprimento de onda podem representar um composto de múltiplos processos coincidentes. Além disso, quaisquer mudanças na forma e posição da banda também influenciarão as amplitudes e constantes de tempo extraídas do ajuste de comprimento de onda único. Essas questões podem ser contornadas em alguns casos por um método de ajuste chamado "análise de forma de banda", onde se determina ou assume uma forma funcional para as bandas TA de cada espécie absorvedora no sistema. Essas formas são então ponderadas por amplitudes dependentes do tempo e somadas para reproduzir o espectro observado. Esse procedimento é comumente usado na análise de espectros de fluorescência resolvidos no tempo, mas as formas mais complicadas e os componentes sobrepostos das bandas TA tornam esse método sustentável em apenas alguns casos simples, como detalhado em outro artigo¹⁰.

Outra desvantagem do ajuste de comprimento de onda único é que ele não aproveita intrinsecamente a ampla faixa espectral proporcionada pelos experimentos modernos de AT. Poder-se-ia, em princípio, ajustar metodicamente cada comprimento de onda individual dos espectros, mas tal análise é pesada, demorada e computacionalmente cara. Para combater esse desafio, um método chamado "análise global" pode ser usado para ajustar simultaneamente um conjunto inteiro de espectros de TA a um conjunto de parâmetros dinâmicos compartilhados⁴. A análise global, e um método intimamente relacionado chamado análise de alvo, são métodos bem-sucedidos e amplamente utilizados, mas também vêm com seu próprio conjunto único de desvantagens e limitações. Como em qualquer modelo, é imperativo compreender os pressupostos que são usados para criá-lo, bem como as limitações que eles apresentam.

Na análise global, os espectros TA são representados por uma matriz m por n, onde m representa o número de comprimentos de onda medidos em cada espectro e n representa o número de pontos de tempo coletados. Esta matriz é então assumida como decomponível no produto de duas outras matrizes:

(3)

onde C(t) é uma matriz n por k e S(λ) é uma matriz m por k. O valor k representa o número de componentes espectrais distintos usados para reproduzir os espectros. Cada um desses componentes representa uma espécie absorvente com uma assinatura espectral e dinâmica únicas. A matriz S(λ) representa os espectros TA dos componentes k e C(t) suas concentrações dependentes do tempo. Na implementação mais simples e comum da análise global, cada componente é assumido como tendo cinética exponencial única (i = 1 na Equação 2, com cada componente atribuído sua própria constante de tempo). Em resumo, o espectro TA completo pode ser representado pela soma dos componentes dos espectros k, cada um com seu próprio espectro de absorção característico e decaimento exponencial único.

Quando os espectros TA são ajustados, o usuário adivinha quantos componentes (ou seja, um valor para k) são necessários e faz um palpite na constante de tempo associada a um decaimento exponencial único dessas espécies. O montador então gera C_guess(t) e resolve a Equação 3 para S_fit(t). Em seguida, S_fit(λ) e C_guess(t) são multiplicados como na Equação 3 para criar os espectros ajustados, ΔA(λ,t)_fit. Finalmente, os resíduos, ΔA(λ,t)_exp − A(λ,t)_fit, são minimizados e as constantes ótimas de S_fit(λ) e tempo retornadas. A relativa simplicidade da análise global, representando um conjunto inteiro de espectros usando um punhado de constantes de tempo e componentes espectrais fixos, torna-a um método atraente (e bem-sucedido) para desembaraçar as complicadas formas de banda e dinâmica encontradas na espectroscopia TA. No entanto, deve-se tomar cuidado para garantir que a análise global seja um modelo apropriado para o sistema em questão.

Uma suposição chave na análise global, ilustrada na Equação 3, é a separabilidade completa das porções de comprimento de onda e tempo da dinâmica, uma propriedade chamada 'bilinearidade'. Essa suposição requer que as formas de banda dos componentes sejam independentes do tempo (ou seja, tenham uma forma espectral fixa que não varia ou muda com o tempo). A única coisa que muda durante o experimento são as populações relativas de cada componente, representadas por C(t). Em escalas de tempo longas, ~1 ns ou mais, essa suposição normalmente se mantém e a análise global pode ser usada sem muita preocupação. Por outro lado, processos de estado excitado, como resfriamento vibracional e dinâmica de solvatação, proeminentes nas escalas de tempo ultrarrápidas acessíveis pelo femtossegundo TA, resultam em mudanças dependentes do tempo na assinatura espectral de uma espécie e uma quebra da bilinearidade. Isso não significa que a análise global não possa reproduzir um conjunto de dados, na verdade, ela sempre pode produzir um ajuste satisfatório desde que um número suficiente de componentes seja usado. O problema, então, está em interpretar os espectros dos componentes e atribuir as constantes de tempo a processos particulares de estado excitado, já que os componentes podem não corresponder mais a espécies absorvedoras distintas. Portanto, deve-se sempre ter cuidado ao aplicar a análise global a situações em que a bilinearidade não pode ser assumida.

Atribuindo a interpretação espectral ao modelo/ajuste: Uma vez obtido um ajuste, a interpretação espectral deve ser mapeada para os tempos de vida obtidos no ajuste. Os tempos de vida do ajuste são atribuídos a processos e reações que foram identificados na interpretação inicial dos espectros. No entanto, a avaliação inicial a partir dos espectros e o número de tempos de vida ajustados obtidos pelo modelo podem não ser mapeados imediatamente um para o outro. Nessa situação (comum!), o montador precisa voltar e avaliar a interpretação inicial. Talvez tenha havido um resfriamento vibracional ou outro processo que não foi percebido na avaliação inicial, mas foi identificado no processo de modelagem e ajuste. Ou, talvez, dois conjuntos diferentes de parâmetros de ajuste poderiam reproduzir bem os dados e a interpretação inicial pode orientar qual conjunto de parâmetros de ajuste é escolhido. Nesta etapa final, o montador deve ir e voltar entre a interpretação e o ajuste para encontrar uma descrição que leve a uma atribuição fotofísica plausível das espécies e da dinâmica do sistema. Outros programas de ajuste que incluem modelos de ajuste sequencial, como a análise de alvo, também podem ser explorados para complementar os ajustes obtidos pela análise global e pelo software de ajuste apresentado neste artigo⁴.

Em resumo, este protocolo discute a preparação e o ajuste de dados de absorção transitória. Seu objetivo é destacar os desafios associados ao processo e comentar formas de evitá-los ou mitigá-los de forma prática. O ajuste de dados de AT, como o ajuste da maioria dos dados encontrados em campos técnicos, pode ser complicado e, às vezes, subjetivo. Portanto, estar ciente do processo e das limitações dos dados, da preparação dos dados e das ferramentas matemáticas usadas para modelar e atribuir significado aos dados são fundamentais. Os cientistas devem abordar os dados e a modelagem com um olhar crítico.

Pode-se tentar mitigar a subjetividade de seus ajustes. Por exemplo, os dados podem ser preparados e ajustados a partir de diferentes pontos de partida e em dias diferentes para garantir que o mesmo ajuste seja produzido. Dados obtidos em dias diferentes com diferentes preparos de amostras podem ser comparados. Vários pesquisadores podem ajustar os mesmos dados e comparar seus resultados. Ao longo do tempo, os pesquisadores podem construir uma intuição sobre os dados que obtêm (com base nas especificidades de sua configuração experimental e parâmetros experimentais) que lhes permitirá ter mais confiança em seus ajustes.

Há muito o que aprender sobre o ajuste de dados de AT e os detalhes dos modelos discutidos neste artigo. Vários excelentes artigos de revisão são entusiasticamente recomendados que se aprofundam neste tópico ^4,10,27. Este protocolo destina-se a ser uma porta de entrada para iniciantes no processo de análise e ajuste que estimula o interesse em compreender mais profundamente o processo.