En introduktion til behandling, tilpasning og fortolkning af forbigående absorptionsdata

Transient absorption (TA) spektroskopi er en tidsopløst spektroskopisk teknik, der overvåger udviklingen af foto-exciterede arter gennem tidsafhængige ændringer i deres absorptionsspektrum efter excitation med en lyspuls. Fordi TA er en absorberende teknik, kan spektroskopiske signaler, der opstår fra tilstande, der gennemgår både strålingsovergange (dvs. tilstande, der typisk udsender en foton) og ikke-strålingsovergange (tilstande, der typisk er ikke-fluorescerende og gennemgår intern konvertering, krydsning af systemet eller deltager i fotoreaktioner) identificeres, og deres udvikling følges ^1,2. Afhængigt af specifikationerne for excitationskilden og detektionsmetoden giver TA adgang til kinetik fra femtosekunder til ud over mikrosekunder og fra UV til fjern IR, hvilket gør det til et alsidigt spektroskopisk værktøj. Kommercialiseringen af TA-spektrometre er avanceret betydeligt i løbet af de sidste årtier, hvilket har ført til, at flere laboratorier og faciliteter har adgang til denne kraftfulde teknik².

Moderne TA-systemer er i stand til at producere store datasæt med høj energisk og tidsmæssig opløsning. Datasættene har generelt form af en 2D-matrix af transmissions- eller absorbansforskelværdier som funktion af bølgelængde og tidsforsinkelse i forhold til excitationspulsen. Dette datasæt kan ses som et todimensionelt varmekort eller et tredimensionelt topografisk kort. Fortolkningen af disse data er blevet mere kompleks, da forskere stræber efter at inkludere hele datasættet, når de genererer pasninger, der bedst beskriver deres interessesystem³.

Selvom TA kan dække en bred vifte af bølgelængder og tidsskalaer, fokuserer denne protokol på en af dens mest tilgængelige former⁴: bredbåndsspektroskopi i det UV-synlige område drevet af en femtosekundpulserende laser. Figur 1 indeholder et skema på ^5,6 for et sådant instrument. Eksperimentet begynder med at tage en puls fra laseren og opdele den i to kopier. En kopi af pulsen, kaldet 'pumpen', bruges til at excitere prøven. En enhed såsom en optisk parametrisk forstærker (OPA) bruges typisk til at omdanne pumpepulsen til den ønskede excitationsbølgelængde ^5,7. Den anden kopi af pulsen, kaldet 'sonden', går ind i et mekanisk forsinkelsestrin, som kan variere tidsforsinkelsen mellem pumpen og sondeimpulserne ved at variere den afstand, pulsen rejser. Sondepulsen med en bølgelængde omdannes derefter til et hvidt lyskontinuum ved hjælp af en safir- eller calciumfluorid (_CaF2) krystal⁸. Den hvide lyspuls ledes gennem prøven, og dens spektrum måles ved hjælp af en bredbåndsdetektor såsom et CCD-kamera (charge-coupled device). Ved at måle ændringer i spektret af hvidlyspulsen med og uden pumpen kan ændringer i prøvens absorptionsspektrum induceret af pumpen, ΔA(T), måles. Interesserede læsere henvises til denne nyttige anmeldelse⁹ for at få flere oplysninger om registreringsprocessen.

I alle former for TA-spektroskopi beregnes ΔA(t)-spektrene ved at tage forskellen mellem jordtilstandssonden,_A-sonden, og den ophidsede tilstand,_A-pump+sonde, ved en given tidsforsinkelse, t, mellem de to impulser 2,5,9,10.

(1)

Bemærk, at en_sonde svarer til prøvens steady-state-absorptionsspektrum og er tidsuafhængig; eksperimentets tidsopløsning stammer fra forsinkelsen mellem pumpen og sonden fanget i A_{pumpe + sonde} (t). En simulering af disse data er vist i figur 2A.

I modsætning til steady-state absorptionsspektre kan TA-spektre have både positive og negative egenskaber på grund af forskellen taget i ligning 1. Positive egenskaber er resultatet af nye absorberende arter skabt af pumpepulsen og kan repræsentere ophidsede kromofortilstande, triplettilstande, geometriske omlejringer, opløsningseffekter eller excited-state fotoprodukter³. Generelle retningslinjer for identifikation af disse egenskaber og tildeling af dem til kemiske arter vil blive præsenteret i diskussionen. Negative egenskaber kan opstå som følge af enten jordtilstandsblegemiddel (GSB) eller stimuleret emission (SE) (figur 2B). GSB skyldes tabet af jordtilstandsbefolkning efter absorption af pumpepulsen. Molekyler, der fremmes til den ophidsede tilstand, absorberer ikke længere i samme region som deres grundtilstand; derfor absorberes mindre af sondepulsen, og forskellen i ligning 1 kan være negativ i dette område. GSB er kendetegnet ved at have samme spektrale form som jordtilstandsabsorptionen, men med et modsat tegn. SE-signaler stammer fra emission fra en exciteret tilstandsart stimuleret af sondepulsen³. Emission fra disse arter resulterer i, at mere lys når detektoren, hvilket svarer til at have mindre absorption ved disse bølgelængder. SE-signalet vil have en lignende spektral form som artens spontane emissionsspektrum, men med et negativt tegn og en anden frekvensvægtning¹⁰.

Ud over information om excited-state arter kan TA-spektre indeholde en række artefakter og fremmede træk, der kan forvrænge den underliggende dynamik og skjule tildelingen af absorptionsbånd¹¹. Forkert behandling af disse artefakter i dataforberedelsen og -analysen kan føre til anvendelse af uhensigtsmæssige fotofysiske modeller på dataene og dermed til vildledende konklusioner¹¹. Derfor fokuserer den første del af denne protokol på, hvordan TA-datasæt behandles korrekt, efter at de er indsamlet. Målet med dette afsnit er at give forskere, der er nye inden for TA, et sæt retningslinjer, der vil hjælpe med at udvikle en intuition og påskønnelse af den strenge forberedelse og behandling af deres data.

Når et datasæt er behandlet, er der en overflod af værktøjer og modeller til rådighed til tilpasning og fortolkning af spektrene med forskellige niveauer af kompleksitet og stringens¹⁰. Målet med anden del af denne protokol er at forberede læseren til at anvende enkeltbølgelængdetilpasning og global analyse på data og give vejledning om, hvornår disse modeller er egnede til at beskrive deres data. Kommerciel software er nu let tilgængelig til forberedelse og behandling af TA-data, såsom Surface Xplorer ^12,13 fra ultrahurtige systemer (gratis at downloade og bruge, se materialetabel). Andre gratis alternativer er blevet frigivet af akademiske forskere, såsom Glotaran¹⁴. Glotaran er et gratis softwareprogram udviklet til global og målrettet analyse af tidsopløste spektroskopi- og mikroskopidata. Det fungerer som en grafisk brugergrænseflade (GUI) til R-pakken TIMP¹⁴. Derudover kan brugerne bruge programmeringssprog som Python til at skrive deres egne koder, der udfører analysen. Hver af disse tilpasningssoftware og programmeringsløsninger har positive funktioner, der gør dem vigtige bidrag. Med henblik på denne undersøgelse kan vi kun præsentere en software til den visuelle komponent i denne aktivitet. En grundig diskussion af hver tilpasningssoftware ligger uden for denne artikels anvendelsesområde.

Denne artikel indeholder en trinvis procedure for (1) behandling af TA-data, (2) tilpasning af TA-data ved hjælp af enkeltbølgelængdekinetik og global analyse og (3) udtrækning af data og tilpasning af dem til andre modeller. Der indgår et sæt repræsentative tekniske oplysninger, som læseren kan bruge i praksis (supplerende fil 1 og supplerende fil 2). Dataene er en måling af en 165 μM prøve af 1, 4-bis(5-phenyloxazol-2-yl)benzen (POPOP) i ethanol exciteret ved 330 nm og indsamlet over et interval på -5 ps til 5,5 ns. Derudover blev en "blindprøve" prøve, der kun indeholdt ethanol og ingen prøve, indsamlet under de samme forsøgsbetingelser over et interval på -5 ps til 5 ps, som bruges til at forberede dataene til tilpasning (trin 1). Spektre blev indsamlet ved hjælp af et ultrahurtigt transient absorptionsspektrometer. Prøven var indeholdt i en 2 mm banelængde kuvette og udsat for konstant omrøring. Den beskrevne behandlings- og tilpasningsprocedure er baseret på Surface Xplorer-softwaren, der passer til data i *.ufs-formatet, og som heri kaldes "tilpasningsprogrammet". Programmer til konvertering af datasæt i andre formater til *.ufs-filer er tilgængelige¹⁵. Selvom detaljerne i denne protokol er specifikke for Surface Xplorer, kan de følgende trin generaliseres til enhver softwarepakke, kommerciel eller hjemmebygget. Derudover kan resultaterne af databehandlingen udvindes og tilpasses ved hjælp af disse andre softwarepakker. En supplerende informationsfil (supplerende fil 3) indeholder yderligere råd om tilpasning.

1. Klargøring af data til montering

1. Indlæs SAMPLE-datasættet i tilpasningssoftwaren. Data vises som vist i supplerende figur 1.
2. Når spredt excitationslys er til stede i eksperimentets optiske detekteringsvindue, skal du bruge indstillingen Træk spredt lys fra (supplerende figur 2). Hvis der ikke er noget spredt excitationslys i dataene, skal du fortsætte til trin 1.5.
   BEMÆRK: Spredt lys observeres oftest, når excitationsbølgelængden falder inden for det optiske vindue. Spredt lys fremstår som en skarp negativ (blegemiddel) funktion ved excitationsbølgelængden (eller en diffraktionsrækkefølge eller bølgelængde produceret i OPA), der ikke varierer med tiden.
3. Klik på menuen Overflade , og klik derefter på indstillingen Træk spredt lys fra (supplerende figur 2). Et nyt vindue vises.
4. I det nye vindue skal du klikke på pileknapperne for at indstille antallet af baggrundsspektre til gennemsnit (supplerende figur 3) for at udføre baggrundskorrektion. Brug af ti spektre giver et godt udgangspunkt, og tallet kan justeres efter ønske. Klik på Accepter for at udføre subtraktionen (fortsæt til trin 1.7).
   BEMÆRK: Baggrundsspektre trækkes fra de første spektre, der findes i datasættet, og bevæger sig derefter fremad tidsmæssigt ved hjælp af så mange baggrundsspektre, som det er nødvendigt for at give gennemsnit af baggrundssignalet; Brug af for mange vil dog begynde at bruge spektre, der indeholder signalet af interesse, så brug ikke for mange. Med data med lange tidsvinduer vises spredningsfunktionen muligvis ikke i slutningen af tidsvinduet med data. Dette kan forekomme, hvis tidsvinduet overskrider kameraets integrationstid eller andre årsager baseret på, hvordan TA-eksperimentet er konstrueret. For at rette op på dette kan indstillingen Indstil tidsinterval bruges som beskrevet i Supplerende fil 3.
5. For data, hvor der ikke er noget spredt lys til stede i det optiske vindue, skal du klikke på Surface-menuen og derefter klikke på indstillingen Træk baggrund fra.
6. I vinduet, der vises, skal du klikke på pileknapperne nederst til højre for "Antal spektre" til gennemsnit (vælg 10), og klik på Accepter.
   BEMÆRK: Baggrundsspektre i denne indstilling fungerer på samme måde som i indstillingen "Træk spredt lys fra". Startende med ti spektre giver god gennemsnit. Der kan anvendes flere spektre, men man skal passe på ikke at bruge for mange for at undgå at inkludere spektre, der indeholder interessesignaler. Brugervejledningen til Surface Xplorer beskriver forskellene i den anvendte korrektion for "Subtract Scattered Light" vs. den mere grundlæggende korrektion "Træk baggrund fra". Det er vigtigt at anvende den passende korrektion for artefakten¹⁶.
7. Data nær kanterne af det optiske vindue kan have et meget lavt signal-støj-forhold som følge af sondespektrets form og/eller prøven, der absorberer for meget af det hvide lys. Støjende data i disse regioner gør analysen vanskeligere. Fjern disse uhensigtsmæssige dele af spektret. Klik på slutbølgelængderne på spektret (nederste venstre flise), indtast nye værdier (supplerende figur 4), og klik på enter. Vælg et bølgelængdeområde, der fjerner de støjende data i kanterne af vinduet. For de leverede data er området 340-680 nm.
8. Afslut justeringen af spektralvinduet til det ønskede bølgelængdeområde. Klik på menuen Overflade , og klik derefter på Beskær (supplerende figur 5). Et pop op-vindue vises.
   1. Klik på OK. Klik på menuen Filer , og klik derefter på Gem fil som. Klik derefter på OK. Luk dette datasæt.
      BEMÆRK: Vær forsigtig, når du beskærer, da funktionen beskærer data langs både bølgelængde- og tidsforsinkelsesakserne og sletter alle andre data. Sørg for, at tidsforsinkelsesvinduet indeholder den del af dataene, der skal bevares. Det anbefales også kraftigt at gemme alle beskårne data som en ny, korrekt mærket fil for at lade rådataoverfladen være intakt som en sikkerhedskopi.
9. For data indsamlet på fs- eller ps-tidsskalaerne skal der anvendes en chirpkorrektion. Dataoverfladen åbnes kun med opløsningsmidlet eller substratet (ingen prøve) udtaget i samme forsøgsopstilling som dataene. Dette eksempel kaldes den "tomme" eksperimentkørsel. Udfør det samme sæt trin på de "tomme" data (fra trin 1.2 til trin 1.8), der blev udført på eksempeldataene.
   BEMÆRK: Det anbefales kraftigt, at et sådant "tomt" eksperiment køres under de samme betingelser som prøven, men med et kortere tidsvindue (f.eks. ~ -5 ps til 5 ps) for at sikre et højt antal punkter omkring tid nul. Denne "blindprøve" serie bør kun bestå af opløsningsmiddel eller substrat, afhængigt af prøvetypen, og bruges til at etablere kvidrenrumningen. Forberedelse af "blindprøven" indtil dette punkt skal følge samme baggrundskorrektion og beskæring som prøvedataene. Hvis der ikke blev kørt en "blank", kan kvidrekorrektionen udføres direkte på datasættet.
10. Start kvidrekorrektionsprocessen. I varmekortflisen (øverst til venstre) skal du klikke på trådkorset og trække den lodrette linjekomponent til den blå ende af spektret. Start på det blå bølgelængdeområde nær starten af spektralvinduet. Klik på menuen Kinetik , og klik derefter på Fit Solvent Response.
    BEMÆRK: Tilpasningsopløsningsmiddelrespons bør kun udføres på en "blind" prøve, der ikke genererer noget signal forbi tid nul. Forsøg på at anvende denne tilpasningsfunktion på et datasæt, der indeholder data om et molekyle eller materiale af interesse, vil resultere i, at programmet forsøger at tilpasse dataene i stedet for IRF (instrumentresponsfunktion). For "blindprøve" prøver skal det eneste signal, der er til stede, være en sammenhængende artefakt, der stammer fra tværfasemodulation. Tværfasemodulation forekommer kun, hvor pumpe- og sondebjælkerne overlapper hinanden og giver derfor et spor af kvidrenumningen, der kan tilpasses ved hjælp af indstillingen "Fit Solvent Response". Manuel placering af punkter vil være påkrævet for data uden et ledsagende "tomt" til brug for korrektion og er beskrevet mere detaljeret i supplerende fil 3.
11. Et nyt vindue "Tilpas opløsningsmiddelrespons" åbnes. Klik på knappen Tilpas (supplerende figur 6). Tilpasningen vil generere en tilpasning til instrumentresponsfunktionen ved hjælp af den første og anden derivat af en Gaussian. Klik på knappen Gem , og klik derefter på x for at lukke skærmen.
    BEMÆRK: Den røde tilpassede linje skal matche datapunkterne (blå hule firkanter) godt over hele tidsintervallet, vigtigst af alt den store funktion, der ses nær tid nul (0,1-2,0 ps). Pasformen vil have mest succes, hvis der er et stort antal point omkring tid nul, hvilket kan opnås ved at bruge et kort tidsforsinkelsesvindue til det "tomme" eksperiment og beholde et stort antal point. Hvis tilpasningen ikke ser ud til at matche datapunkterne godt, skal du markere afkrydsningsfeltet "Tilføj Gaussisk (R0)" og prøve tilpasningen igen. Denne mulighed tilføjer en sum af Gaussian til den første og anden derivat og passer muligvis bedre til IRF-funktionsformen ved denne bølgelængde. Hvis tilpasningen af opløsningsmiddelresponsen stadig ikke kan fange IRF-signalet, skal du vælge en anden bølgelængde.
12. Udfør denne proces (trin 1.10-1.11) mindst fem gange, da der kræves fem punkter for korrekt at korrigere for en kvidren. Punkterne skal om muligt fordeles ud over hele spektralvinduet. Nogle opløsningsmidler/substrater genererer muligvis ikke et observerbart signal i dele af spektralvinduet, afhængigt af eksperimentelle betingelser. Flere point kan tilføjes/bruges efter behov for at producere en acceptabel pasform. Når du er færdig, skal du lukke det "tomme" datasæt.
    BEMÆRK: Hvert gemt punkt skrives til en Excel-fil i arbejdsmappen som en ny række, så snart brugeren klikker på Gem. Hvis et uønsket punkt gemmes, kan punktet fjernes fra Excel-filen ved at slette det uønskede punkts række.
13. Åbn det beskårne datasæt og det fratrukne baggrundsdatasæt igen. Klik på Surface-menuen , og klik derefter på indstillingen Chirp Correction . Dette åbner en ny skærm med tre vinduer og en menu nederst til højre (supplerende figur 7).
14. Tilføj den kvidrekorrektion, der lige er oprettet. Klik på Tilføj fra filindstilling , vælg Excel-filen, der slutter med "passende koefficienter", og klik på OK. Kvidrekorrektionstilpasningen vises nu i øverste venstre vindue som en sort linje med X-markører (supplerende figur 8).
    BEMÆRK: Kvidrekorrektionen vises som en ubrudt linje; X-markørerne langs linjen er de punkter, der genereres fra tilpasningsopløsningsmiddelresponsprocessen. Point kan tilføjes manuelt ved at justere trådkorset og klikke på Tilføj. Punkter kan også fjernes ved at fremhæve dem og trykke på Fjern. Yderligere punkter kan håndredigeres ved at indtaste værdier i listen nederst til højre. Endelig kan den aktuelle rettelse, hvis det ønskes, også gemmes som en fil til senere genbrug ved hjælp af knappen Gem i fil .
15. Klik på knappen Forhåndsvisning af chirpkorrektion . Dette gælder midlertidigt chirp-korrektionen. Overhold korrektionen i øverste venstre vindue for at sikre, at dataene er blevet midlertidigt fladtrykt, og at der ikke kan observeres mere krumning.
    1. Hvis du er tilfreds med kvidrekorrektionen, skal du klikke på knappen Anvend & Afslut . Hvis du ikke er tilfreds, gentages trin 1.10-1.14, idet du vælger flere (eller forskellige) bølgelængder til kvidrekorrektionstilpasningen, indtil der opnås en tilfredsstillende korrektion.
       BEMÆRK: Anvendelse af chirpkorrektionen justerer tiden nul til den rettede linje, som den vises i forhåndsvisningen. Der kan være en vis tidsmæssig forskydning mellem den "tomme" og dataoverfladen.
16. Klik på menuen Filer, og klik derefter på Gem fil som. Skriv et passende navn til filen for at angive, at der er anvendt en chirp-korrektion. Klik derefter på OK.
17. Nogle spredningsfunktioner i dataene fjernes muligvis ikke helt, når du udfører baggrundssubtraktionen. Disse funktioner påvirker tilpasningen og giver fejlagtige tilpasningsresultater. Find sådanne funktioner i de data, der skal fjernes. Spredningsfunktionen kan lettest identificeres i det negative tidsområde.
    1. I øverste venstre varmekortflise skal du klikke og trække trådkorset til det negative tidsområde. Hold dig inden for det negative tidsområde, brug trådkorset til at bestemme de bølgelængder, hvor spredningsfunktionen begynder og slutter. Bemærk bølgelængdeområdet for spredningsfunktionen (for det angivne datasæt er funktionsområdet 654 nm til 672 nm).
       BEMÆRK: Når du skal afgøre, om en funktion skal fjernes, skal du trække det vandrette trådkors op og ned gennem tidsakserne for at visualisere funktionens spektralområde. Spredningsfunktioner har typisk meget støjende kinetiske spor med en bølgelængde, så funktionens spektralområde kan også verificeres ved hjælp af de kinetiske spor.
18. Start med den nedre (blå) bølgelængde (dvs. 654 nm), klik på højre bølgelængde på spektret (nederste venstre flise) og indtast værdien af den nederste (blå) funktionsomfang.
19. Beskær dataene ved at klikke på menuen Surface , og klik derefter på Beskær. Klik på OK i pop op-menuen. Gem de beskårne data med et entydigt filnavn for at angive, hvilken side af dataene det er (blå eller venstre anbefales). Luk filen.
20. Åbn filen med den anvendte chirp-korrektion gemt i trin 1.16. Fortsæt til funktionens højere (røde) bølgelængdeomfang. Klik på venstre bølgelængde på spektret (nederste venstre flise), og indtast værdien af funktionens højere omfang.
21. Beskær dataene ved at klikke på menuen Surface , og klik derefter på Beskær. Klik på OK i pop op-menuen. Gem de beskårne data med et entydigt filnavn for at angive, hvilken side af dataene det er (rød eller højre anbefales).
22. Kombiner de to filer ved at klikke på menuen Filer , og klik derefter på Kombiner flere overflader. I det nye vindue skal du vælge begge sider af dataene (dvs. højre og venstre eller blå og rød). Brug ctrl + klik for at vælge hver fil. Kontroller, at begge filer er valgt i feltet "Filnavn:", og klik derefter på OK nederst til højre. Når statuslinjen er færdig, er dataene kombineret.
    BEMÆRK: Et vilkårligt antal filer kan kombineres på denne måde. Data kan sys sammen på tværs af flere snit i både tids- og bølgelængdeakserne.
23. Klik på menuen Filer , klik derefter på Gem fil som , og vælg et unikt filnavn for at angive, at det er kombineret (kombineret eller sammensat anbefales). Klik derefter på OK for at gemme filen.
    BEMÆRK: Se afsnit 3 for oplysninger om, hvordan du gemmer data fra rådatavinduet til senere visning og plotning. Dataene i varmekortet (øverste venstre flise) skal vises som i figur 3 og er nu klar til at blive tilpasset. Visualisering af de repræsentative spektre, som vist i figur 3, er beskrevet i trin 3.1.2.

2. Udførelse af en pasform

1. Indlæs den korrekt forberedte dataoverflade.
2. Bestem, hvilken montering der skal udføres, og flyt til det relevante afsnit.
   BEMÆRK: Denne protokol præsenterer to datatilpasningsmuligheder: trin 2.3 præsenterer tilpasning af kinetisk sporing med en bølgelængde, og trin 2.4 præsenterer global analysetilpasning.
3. Enkelt bølgelængde tilpasning
   1. For at indstille en enkelt kinetisk tilpasning skal du flytte markøren (enten i øverste eller nederste venstre flise) til den ønskede bølgelængde. Klik på menuen Kinetik , og klik derefter på Tilpas kinetisk. For det angivne datasæt skal du starte med 632 nm.
   2. I det nye vindue, der åbnes (supplerende figur 9), skal du bemærke, at de vigtigste tilpasningsparametre og frøværdier er indstillet øverst til venstre i vinduet under programlogoet i boksen ved siden af dette område under teksten "current fit @ wavelength".
   3. Klik på pileknapperne for at justere antallet af levetider (dvs. antallet af eksponentielle henfald, der bruges til at passe dataene) i feltet "Endelige levetider". For det angivne datasæt skal du vælge 2 levetider. En til 3 levetider er typiske som udgangspunkt.
   4. Hvis datasignalet strækker sig ud over det indsamlede tidsvindue, skal en "uendelig" levetidskomponent inkluderes. For at gøre dette skal du klikke på afkrydsningsfeltet Brug uendelig levetid . Hvis dataene henfalder fuldt ud til basislinjen, skal du ikke markere dette afkrydsningsfelt. For det angivne datasæt skal du ikke markere afkrydsningsfeltet.
      BEMÆRK: Den "uendelige levetid" tillader en signalforskydning at forblive (dvs. programmet vil ikke tvinge tilpasningen til at henfalde tilbage til basislinjen). Anvendelse af en uendelig komponent er påkrævet, når signalet ved denne bølgelængde ikke henfalder til basislinjen inden for eksperimentets tidsinterval.
   5. Indtast gætteværdier for levetider og tilhørende amplituder, instrumentresponstid og tid nul for at hjælpe tilpasningsprocessen (supplerende figur 10). Klik på den ønskede parameter. Klik i værdivinduet, skriv en gætværdi, og klik derefter på knappen til det første gæt for at angive værdien. For det angivne datasæt er de relevante gætværdier: 0 = 0 ps, IRF = 0,25 ps, A1 = 0,6, t1 = 100 ps, A2 = 0,08, t2 = 1100 ps.
      BEMÆRK: "0" er estimatet af tid nul, "IRF" er instrumentets responstid, "A" henviser til amplituden af en given eksponentiel (se ligning 3), og "t" er levetids-/tidskonstanten. At give gode gætværdier hjælper programmet med at opnå en rimelig pasform. Vælg "A"-værdier, der ligger inden for værdierne i A-området i datasættet. Vælg "t"-værdier på tidsintervaller, hvor der observeres signifikant ændring i det kinetiske spor. Den bedste måde at få intuition om, hvordan gætværdier påvirker pasformen, er at prøve flere sæt gætværdier og observere de pasformer, de producerer. Hvis en eller flere af disse parametre er kendt, kan parameteren indstilles og "fastgøres", så den ikke varierer med tilpasningen (supplerende figur 11).
   6. Når alle gætparametre er indtastet, skal du klikke på knappen Tilpas . En repræsentativ pasform er vist i figur 4.
      BEMÆRK: Anvendelse af tilpasningen udfylder dataplottet med tilpasningslinjen og et restplot, der kan bruges til at vurdere kvaliteten af tilpasningen. Tilpasningsparametre, såsom levetider og tilhørende amplituder, tid nul og instrumentresponstid, udfyldes også i boksen øverst til venstre. Brug flere forskellige tilpasningsparametre til at bestemme antallet af levetider og inkludering/udelukkelse af en "uendelig" tidskomponent, der giver den bedste tilpasning til dataene.
   7. Gem tilpasningen ved at klikke på knappen Gem (supplerende figur 9).
      BEMÆRK: Se afsnit 3 for oplysninger om, hvordan du gemmer data fra rådatavinduet til senere visning og plotning.
4. Global analyse tilpasning
   1. Klik på Surface-menuen , og klik derefter på indstillingen Hovedkomponenter via SVD . Der vises et nyt vindue (supplerende figur 12).
      BEMÆRK: Øverste højre vindue viser de vigtigste kinetiske spor, og nederst til venstre vises hovedspektrene. Den øverste venstre flise viser et plot af den resterende overflade, der er skabt af forskellen mellem den oprindelige overflade og en overflade skabt af de valgte hovedkomponenter.
   2. Klik på pileknapperne for at indstille "Antal hovedkomponenter" (supplerende figur 12). For det angivne datasæt skal du vælge 15.
      BEMÆRK: Når man beslutter antallet af hovedkomponenter, der skal vælges, er en måde at fortsætte med at øge antallet, indtil både hovedspektrene og de vigtigste kinetiske spor ligner et støjmønster. En anden måde at bestemme, hvor mange hovedkomponenter der skal vælges, er ved at se på vægtkoefficientværdierne, der vises til venstre for forklaringen i øverste højre flise. Fortsæt med at tilføje hovedkomponenter, indtil denne værdi når 0,01. Generelt er det tilrådeligt at tilføje et par mere ud over dette for god ordens skyld. Dette kan resultere i, at så mange som 15 eller flere hovedkomponenter vælges.
   3. Klik på knappen Gem . Gemte hovedkomponenter er nødvendige for at gå videre til næste trin.
      BEMÆRK: Hver hovedkomponent er en reduceret kompleksitetsrepræsentation af den oprindelige dataoverflade. Brug af hovedkomponenter vil resultere i en forenklet overflade sammenlignet med de rå data, der analyseres. Regnskab for de fleste af de vigtigste funktioner i dataoverfladen er meget vigtigt for at få en nøjagtig pasform, så det er nøglen til at bruge nok hovedkomponenter til at fange disse funktioner. Brug af flere hovedkomponenter vil ikke kompromittere pasformen. Hvis der derfor er tvivl om, hvor mange hovedkomponenter der skal vælges, skal du bruge flere hovedkomponenter i stedet for færre. Husk, at brug af for mange kan bremse tilpasningssoftwaren.
   4. Når du har gemt hovedkomponenterne, vender programmet tilbage til hovedskærmen, og global tilpasning kan nu forsøges. Klik på Surface-menuen , og klik derefter på indstillingen Global Fit . Et nyt vindue åbnes (supplerende figur 13).
      BEMÆRK: De vigtigste kinetiske spor vises i øverste højre flise. Den øverste venstre flise viser en overflade af tilpasningsoverfladen sammenlignet med den rå overflade. Den nederste venstre flise viser de henfaldsassocierede forskelsspektre (DADS), der genereres af tilpasningen. Endelig er den nederste højre flise, hvor tilpasningsparametrene kan indstilles, herunder antallet af eksponentielle funktioner, der skal bruges, og om der skal bruges en uendelig funktion.
   5. Brug pileknapperne ved siden af "antal exp." til at indstille antallet af eksponentielle funktioner, der skal medtages i tilpasningen. Hvis datasignalet strækker sig ud over det indsamlede tidsvindue, skal en "uendelig" levetidskomponent inkluderes. For at gøre dette skal du klikke på afkrydsningsfeltet Brug forskydning (Ainf). For det angivne datasæt skal du vælge 2 og ikke klikke på feltet. Hvis dataene henfalder fuldt ud til basislinjen, skal du ikke markere dette afkrydsningsfelt.
      BEMÆRK: Tilpasningsparametre kan rettes, før du udfører en tilpasning ved at klikke på etiketkolonnen nederst til højre under globale tilpasningskoefficienter. Etiketten bliver rød og ændres til at have en (fast) indikator på etiketten. Enhver værdi, der indtastes i boksen til højre, vil blive brugt til den parameter i stedet for frit varieret for tilpasningen. Der skal udvises forsigtighed, når der fastsættes værdier for en pasform, da dette kan påvirke tilpasningsresultaterne.
   6. Klik på knappen Fit . Tilpasningsfremskridt vises via en lille indlæsningsbjælke i midten af skærmen. Når tilpasningsforløbet er afsluttet, udfyldes vinduerne med data fra tilpasningen (figur 5 og supplerende figur 14). Undersøg visuelt tilpasningsresultaterne.
      BEMÆRK: Oplysninger fra både den primære kinetiske pasform og DADS bruges til at afgøre, om pasformen er værd at gemme eller er for dårlig. Generelt, hvis tilpasningen af de vigtigste spor matcher godt med dataene, og der ikke er nogen eller meget få funktioner i plottet , kan tilpasningen accepteres. Det er nemt at kontrollere flere tilpasninger ved at ændre antallet af levetider og/eller markere/fjerne markeringen af knappen "Brug forskydning (Ainf)". Den bedste pasform, der fremstilles efter kontrol af flere variationer af tilpasningsparametrene, bør accepteres.
   7. Klik på knappen Gem . Dette gemmer den aktuelt viste pasform sammen med dataene i en Excel-fil.
      BEMÆRK: Excel-filen gemmes på samme filplacering som datasættet. Hvis der udføres yderligere tilpasninger, og de skal gemmes, overskriver de enhver tidligere version. Som sådan, før du genererer og gemmer en ny pasform, skal du give enhver gammel pasform et unikt navn. Parametre, der gemmes fra tilpasningen, inkluderer kun tid nul, IRF, levetider og deres ledsagende DADS. Dette dossier indeholder ingen oplysninger om observationsområdet eller tilpasningen af de vigtigste kinetiske spor. Lagring af de vigtigste kinetikspor er beskrevet i trin 3.3. Se trin 3.0 for at få oplysninger om, hvordan du gemmer data fra rådatavinduet til senere visning og afbildning.

3. Udtrækning af rådata og passer fra tilpasningssoftwaren til plotning

BEMÆRK: Rådata eller tilpasninger, der er produceret fra enkelt bølgelængdetilpasning eller global analyse, kan eksporteres til csv-filer, der kan åbnes i en række andre programmer.

1. Udtrækning af rådata til afbildning
   1. For at eksportere varmekortet for datasættet skal du klikke på menuen Filer og derefter klikke på Eksporter til CSV (supplerende figur 15). Dette åbner et vindue, klik på OK for at gemme csv-filen i samme mappe som datafilen, der åbnes med samme navn som datafilen.
      BEMÆRK: Alternativt kan rådata eksporteres ved at højreklikke på varmekortvinduet og klikke på Eksporter data til udklipsholder. Dette gemmer dataene midlertidigt, så de kan indsættes i et softwaredokument efter brugerens valg. Indsæt dataene i en Excel-fil, og gem derefter dataene.
   2. Flere spektre kan vises i vinduet til sammenligning eller med henblik på at lave en figur. Træk den vandrette markør (på varmekortet øverst til venstre) til et ønsket tidspunkt. Tryk på Ctrl + S for at vælge spektret og gemme det i spektralvinduet (nederst til venstre). Tilføj så mange tidspunkter, som det er nødvendigt for at vise udviklingen af dataene (5-10 spektre), som det ses i figur 3.
      BEMÆRK: Antallet af spektre, der er valgt til at repræsentere dataene, og den tidsmæssige placering af disse spektre kan afhænge stærkt af den specifikke prøve og eksperimentelle betingelser. Anbefalingen ovenfor er en generel retningslinje, men eksperimentets specifikationer skal diktere, hvilke dele af datasættet der fremhæves.
   3. Eksporter som data ved at højreklikke på vinduet, der indeholder spektrene. Klik på indstillingen Eksporter data til udklipsholder . Dataene gemmes midlertidigt. Indsæt disse data i det ønskede softwaredokument (dvs. Excel) og Gem.
   4. Flere kinetiske spor kan vises i kinetik vinduet på samme måde som spektrevinduet. Træk den lodrette markør (på varmekortet øverst til venstre) til den ønskede bølgelængde. Tryk på Ctrl + X for at vælge tidssporingen og gemme den i kinetikvinduet (øverst til højre). Tilføj så mange tidspunkter som ønsket. Dette gemmer midlertidigt det aktuelle kinetiske spor i vinduet.
   5. Eksporter som data ved at højreklikke på vinduet, der indeholder de kinetiske spor. Klik på indstillingen Eksporter data til udklipsholder . Dataene gemmes midlertidigt. Indsæt disse data i det ønskede softwaredokument (dvs. Excel) og Gem.
2. Udtrækning af data fra enkelt bølgelængdetilpasning til visning
   1. Klik på menuen Kinetik , og klik derefter på Tilpas kinetisk for at åbne vinduet, der indeholder de tilpassede data.
   2. Højreklik på fit-vinduet (dvs. den centrale flise i vinduet med enkelt pasform). Klik på Eksporter data til udklipsholder. Dette gemmer det midlertidigt, så det kan indsættes i et andet softwareprogram.
      BEMÆRK: Det resterende diagram under tilpasningsdataene kan ikke eksporteres og skal i stedet genoprettes fra tilpasningsdataene. Tilpasningen eksporterer både rådataene og tilpasningslinjen, som derefter kan bruges til at genskabe resten. Restværdien oprettes ved at trække tilpasningsværdien fra dataene på hvert tidspunkt og oprette et plot svarende til det, der vises i vinduet "Fit Kinetics".
   3. Indsæt disse data i det ønskede softwaredokument (dvs. Excel) og Gem.
      BEMÆRK: Eksport til udklipsholderen inkluderer kun rådata og tilpasningslinjedata for hver eksponentiel, der bruges i tilpasningen. Parametrene for pasformen, såsom levetider, amplituder og lignende, medtages ikke og skal eksporteres ved at kopiere værdierne fra tilpasningssoftwaren.
3. Udtrækning af data fra global levetidsanalyse til visning og analyse
   1. Klik på Surface-menuen , og klik derefter på Global Fit-indstillingen for at åbne vinduet, der indeholder de tilpassede data.
   2. Præcisionen for værdierne for både den optiske tæthed og tidsforsinkelses-/bølgelængdeakserne skal justeres for henholdsvis hovedkomponenterne (øverste højre flise) og DADS (nederste venstre flise). Placer musen over hovedkomponentvinduet, indtil indstillingsboksen vises nederst til højre.
   3. Klik hurtigt på x.xx-knappen , hold musen over "Præcision", og klik på 6 i menuen for at indstille antallet af decimaler, der skal medtages.
   4. Placer musen over hovedkomponentvinduet, indtil indstillingsboksen vises nederst til højre. Klik hurtigt på y.yy-knappen , hold musen over "Præcision" og klik på 6 i menuen for at indstille antallet af decimaler, der skal medtages.
   5. Højreklik på vinduet Principal Kinetic Traces . Klik på Eksporter data til udklipsholder. Dette gemmer det midlertidigt, så det kan indsættes i et andet softwareprogram.
   6. Indsæt disse data i det ønskede softwaredokument (dvs. Excel) og Gem.
      BEMÆRK: Dataene gemmes som en række kolonner, der først indeholder tidsforsinkelserne, derefter de vigtigste kinetiske spor efterfulgt af tilpasningslinjen. Der vil være et sæt for hver hovedkomponent, der vælges ved forberedelsen til global analyse. DADS-spektrene er allerede gemt som en del af tilpasningsproceduren i trin 2.4.7.

Forberedelse og analyse af en prøve af 1,4-Bis[2-(5-phenyloxazolyl)]benzen, POPOP i ethanol blev udført efter den ovenfor beskrevne procedure. Målingerne blev udført ved hjælp af et ultrahurtigt transient absorptionsspektrometer, som beskrevet i figur 1, med væskeopløsninger i 2 mm kuvetter ved hjælp af en justerbar kuvetteholder og en magnetisk omrører for at sikre blanding. Prøverne blev målt under omgivende forhold uden yderligere kontrol af temperatur eller atmosfære. Det optiske vindue på 340 nm til 680 nm blev genereret under anvendelse af en calciumfluoridkrystal. To hundrede halvtreds (250) tidspunkter blev indsamlet mellem -5 ps til ~ 5500 ps, og tre scanninger blev i gennemsnit for at generere det endelige datasæt, figur 3. POPOP-dataene blev udarbejdet som beskrevet i protokollen. Et eksempel på suboptimal kvidrekorrektion er vist i supplerende figur 16. Kinetisk tilpasning med enkelt bølgelængde blev udført på POPOP og valgte 632 nm som den relevante bølgelængde. Derudover blev der udført global analyse af POPOP som beskrevet i protokollen.

Kinetisk tilpasning med en enkelt bølgelængde af POPOP ved 632 nm producerede to levetider. Disse levetider fik lov til at variere, og der blev ikke foretaget yderligere justeringer. De endelige parametre opnået var som følger: t0 = -0, 1176 ps, IRF = 0, 436 ps, A1 = 0, 0956, t1 = 1, 614 ps, A2 = 0, 0646, t2 = 522, 2 ps (figur 4). Disse resultater stemmer godt overens med den efterfølgende globale analyse og de rapporterede emissionslevetidsværdier for POPOP (τ = 1,35 ns)¹⁷. Et eksempel på tilpasning med en enkelt bølgelængde med for få levetidskomponenter er vist og diskuteret i supplerende figur 16.

Global analysetilpasning på POPOP blev udført efter valg af 15 hovedkomponenter (pc'er) ved udførelse af SVD. To levetider blev valgt efter montering, ingen parametre blev rettet. De endelige parametre opnået ved montering var som følger: t0 = -0, 1586 ps, tp (IRF) = 0, 4408 ps, t1 = 1459 ps, t2 = 267, 5 ps. De henfaldsrelaterede forskelsspektre er vist i figur 5. Resultaterne var i god overensstemmelse med resultaterne fra enkelt kinetisk tilpasning ved 632 nm og levetidsværdier for POPOP¹⁷. To eksempler på suboptimal global analyse er vist og diskuteret i supplerende figur 16.

Figur 1: Skematisk gengivelse af det transiente absorptionsinstrument for femtosekundbredbånd beskrevet i denne protokol. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 2: Simulering af TAS-data og bidrag til TAS-signal. (A) Gaussiske kurver, der simulerer et jordtilstandsabsorptionsspektrum (blå stiplet linje) og et excited-state-spektrum (rød stiplet linje, rødforskudt fra jordtilstandsspektret). Forskelsspektrene for disse to spektre (lilla, fast linje) er forskelsspektret set i TA. Forskellene mellem jord- og excited-state-spektrene er blevet overdrevet til illustrative formål. B) Et repræsentativt TA-differensspektrum for POPOP ved 1,04 ps efter excitation ved 330 nm. De stiplede linjer viser jordtilstandsabsorbans og steady-state-emission af POPOP. Fremhævede områder viser fælles TA-egenskaber, jordtilstandsblegemiddel (GSB), stimuleret emission (SE) og excited-state absorbans (ESA) observeret inden for disse data. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 3: Forberedte data til POPOP, der er resultatet af anvendelsen af trin 1 - Forberedelse af data. Dataene vises som det korrigerede varmekort og repræsentative spektre. Disse resultater viser, hvordan dataene skal se ud, når korrektionerne er blevet anvendt, og man er klar til at anvende en tilpasning til datasættet. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 4: Resultater af enkelt bølgelængdetilpasning af POPOP ved 632 nm efter anvendelse af trin 2.3 - Montering af enkelt bølgelængde. Figuren viser (øverste sektion) levetiderne opnået i tabelformat, (midterste sektion) dataene (blå prikker) og tilpasningen til dataene (rød tilpasningslinje) og (nederste sektion) restplottet. Bemærk, at under afsnittet "aktuel tilpasning" vises amplituderne (A) som ΔA-værdierne fra de data, der repræsenterer bidraget fra den specifikke levetidskomponent ved t0. Men når den aktuelle tilpasning gemmes og vises i tabellen "Tilpasningskoefficienter", er standardindstillingen at vise de normaliserede amplituder. Denne indstilling kan ændres ved at fjerne markeringen i afkrydsningsfeltet ud for etiketten "Tilpasningskoefficienter" "Normaliseret". Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 5: Resultater af global analyse tilpasning af POPOP opnået efter trin 2.4 tilpasning. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 6: Eksempel på stimuleret Raman-spredning observeret i eksperimentelle TA-data. I dette datasæt (ikke POPOP-dataene vist i selvstudiet) blev prøven spændt ved 550 nm (angivet med den stiplede linje). Ramanspredning ses omkring tid nul og forekommer generelt både til den blå (anti-Stokes Raman-spredning) og til den røde (Stokes Raman-spredning) af pumpeexcitationsbølgelængde. Stimuleret Raman-spredning er kortvarig, typisk kun omkring ~ 200 fs, fordi den forekommer som et resultat af, at sondestrålen interagerer med prøven på samme tid som pumpestrålen og derved stimulerer Raman-processen. Funktionen kan dog ikke undgås og bør fjernes med beskæring. Klik her for at se en større version af denne figur.

Supplerende figur 1: Hovedmenu, når data indlæses første gang. Generelt vil der i denne monteringssoftware være indstillingsbokse, der vises i nederste højre hjørne af et vindue, når vinduet flyttes over. Disse bokse giver mulighed for at ændre markørinteraktionen med vinduet, enten flytte markeringer, zoome eller panorere de valgte vinduer. Der er også muligheder for at justere præcisionen af både x-akse- og y-akseskalaerne for vinduet samt skifte displayet fra lineær til logaritmisk. Akserne kan også låses eller låses op. Mens den er låst, forbliver en akse på det angivne zoomniveau eller interval af værdier; Når det er låst op, skifter området til at indeholde det fulde datasæt. Andre muligheder giver mulighed for at justere visningen af tal og farvningen af gitre, hvis de findes. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur 2: Overflademenu til udførelse af subtraktion af spredt lys. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur 3: Træk skærmen med spredt lys fra - indstil spektrene til gennemsnit. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur 4: Indstilling af beskæringsområde. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur 5: Beskæring af datasæt. Beskårne data fjernes permanent. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur 6: Tilpasningsvindue for opløsningsmiddelrespons og eksempel på tilpasning af opløsningsmiddelrespons (i rød linje) til dataene (blå prikker). Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur 7: Chirp-korrektionsvindue med "tomme" prøvedata. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur 8: Chirp-korrektion vist sammen med datasættet. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur 9: Enkelt kinetisk tilpasningsvindue. Derudover giver en skyder øverst brugeren mulighed for at vælge den bølgelængde, hvormed tilpasningen skal udføres. Valg af en passende bølgelængde kræver kendskab til systemets spektroskopi for at identificere, hvor processer af interesse forekommer. Eksempler omfatter ladningsoverførselsprodukter, tripletdannelse eller fotoproduktdannelse, hvis spektrale egenskaber vides at korrelere med specifikke bølgelængder. Disse specifikke bølgelængder kan være egnede til at opnå levetiderne for disse specifikke begivenheder. Derudover kan et udvalg af bølgelængder bruges til at give validering til en valgt global tilpasningsmodel. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur 10: Indstilling af Single Kinetic Fit-parametre. Individuelle tilpasningsparametre kan fastsættes eller ændres manuelt, hvis det ønskes for at finjustere pasformen og minimere restens standardafvigelse. Bemærk: Parametre kan nemt justeres ved at klikke på værdien i boksen og derefter justere ved hjælp af en skyder eller manuelt indtaste en værdi. Den viste tilpasning justeres i realtid, efterhånden som værdierne ændres. Når der opnås en acceptabel pasform, kan pasformen eksporteres ved at højreklikke på tilpasningsskærmen, hvilket gør det muligt at eksportere dataene til udklipsholderen til indsættelse i et ønsket program eller som et billede til hurtig visning. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur 11: Begrænsning og fastsættelse af værdier for Single Kinetic Fit-parametre kan udføres, hvis en eller flere parametre er velkendte. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur 12: Vindue for nedbrydning af enkelt værdi med hovedkomponenter, der viser, hvordan sporingen og komponenterne vil se ud, når der tilføjes nok hovedkomponenter. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur 13: Global Fit-vindue, før global analyse fit genereres. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur 14: Global Fit-vindue, der viser resultaterne af den globale analysetilpasning. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur 15: Filmenu til lagring og eksport af filer. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur 16: Eksempler på suboptimal kvidrekorrektion og tilpasning. A) udviser dårlig enkelt kinetisk pasform. Den type struktureret rest, der vises i panel A, angiver typisk, at der kræves en ekstra levetid for at tilpasse dataene. Bemærk, at restproduktet falder til under nul på kortere tidspunkter og hæves over nullinjen ved længere levetid. (B) demonstrerer en korrekt kvidrekorrektion ved hjælp af preview-knappen, hvor funktioner er rettet, og der ikke er nogen krumning i dataene. (C) viser en forkert kvidrekorrektion, hvor der er mærkbar krumning til stede i den blå del af spektret, hvilket indikerer, at kvidrefunktionen overkorrigerer i dette område. (D) viser en dårlig global levetidsanalysetilpasning, hvor overfitting (inklusive for mange parametre) har resulteret i "symmetriske" DADS (der ligner spejlbilleder af hinanden på tværs af x-aksen) af lignende levetidsintervaller, der i det væsentlige annullerer hinanden. Når disse funktioner overholdes, bør pasformen ikke bruges. (E) udviser en dårlig global pasform, hvor for mange parametre har resulteret i en meget kort levetid med en meget stor amplitude. Problemet i (E) kan også opstå, hvis artefakter omkring tid nul ikke korrigeres korrekt, og tilpasningen bliver fokuseret på at minimere restproduktet ved at overbetone den meget korte levetid (en, der ikke er fysisk meningsfuld). Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur 17: Eksempel på TAS-data med Ramanspredning. Spredning er til stede omkring tid nul og falder sammen med pumpens excitationsbølgelængde. Spredning består af en række skarpe toppe med en meget intens positiv top blå af pumpens excitation og en negativ top rød af pumpens excitation. Denne funktion kan ikke forhindres med rimelighed og bør beskæres ud af dataene for at undgå at forstyrre tilpasningsresultaterne. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende fil 1: Fil, der indeholder datasættet til dette selvstudium (POPOP data_POPOP-inEtOH.ufs). Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende fil 2: Fil, der indeholder tomt datasæt til dette selvstudium (POPOP data_BLANK.ufs). Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende fil 3: Understøttende informationsfiler med yderligere kommentarer om tilpasning af opløsningsmiddelrespons, korrektion for scatting og fratrækning af overflader. Klik her for at downloade denne fil.

Generelle overvejelser i forbindelse med dataforberedelse
Tilpasning af TA-data kan ved første øjekast synes at være relativt ligetil, og det kan forventes, at der skal resultere et klart korrekt "svar" for et givet datasæt. Som fremhævet i protokollen er der dog mange faktorer i dataindsamling, dataforberedelse og dataanalyse, der nøje skal overvejes, hvilket kan føre til usikkerhed om, hvilken model eller hvilket sæt tilpasningsparametre der bedst beskriver dataene. Målet med dataforberedelse og tilpasning er at reducere så mange af disse fremmede faktorer som muligt, samtidig med at dataene bevares til analyse. Den aktuelle opgave kan virke skræmmende for en nybegynder, da der er meget at overveje. For at opbygge intuition om tilpasningsprocessen opfordres begynderen til at prøve at forberede de samme data flere gange fra bunden på lidt forskellige måder for at kontrollere, hvor dramatisk dataforberedelsestrinnene påvirker den bedste pasform. Derudover kan to forskellige forskere forberede og tilpasse de samme data og sammenligne resultater. Denne proces kan være tidskrævende de første mange gange, men det vil give begynderen mulighed for at udvikle intuition om, hvordan man konsekvent forbereder data til fremtidige prøver. Som enhver færdighed vil denne dataforberedelse og tilpasning tage tid at udvikle, og begynderen opfordres til at være tålmodig og disciplineret, når han eksperimenterer med og lærer processen. Datasættet, der bruges i denne undersøgelse, leveres for at give begynderen chancen for at passe direkte sammen med selvstudiet og direkte sammenligne resultater med dem, der produceres i selvstudiet.

Dataene kan indeholde baggrundstræk , der er til stede ved forsinkelser på alle tidspunkter (supplerende figur 2 og supplerende figur 3), såsom spredning af pumpestrålen og spontan emission af prøven. Disse uønskede træk skal fjernes for at isolere det forbigående absorptionssignal fra de relevante arter¹¹. Fjernelse af sådanne egenskaber sker ved at vælge, beregne gennemsnittet og fjerne bidraget fra et antal negative tidsforskelsspektre. Når du vælger baggrundsspektre, er det vigtigt at sikre, at ingen funktioner, der kan være en del af processen af interesse, medtages til fjernelse. Baggrundstræk hidrørende fra opløsningsmidlet, såsom absorption fra urenheder eller selve opløsningsmidlet, kan også observeres i TA-data. Når opløsningsmidlet producerer et signal, skal et "tomt" datasæt, der kun indeholder opløsningsmidlet, der køres under nøjagtig de samme eksperimentelle betingelser som prøven, trækkes fra prøvedatasættet. Nærmere oplysninger om denne procedure findes i supplerende dossier 3.

Kvidrekorrektionen er en anden faktor, der skal overvejes nøje. Chirp opstår, når sondepulsen bevæger sig til prøven og udvides på grund af ufuldkommenheder i styrespejle eller ved at passere gennem dispersiv optik såsom linser eller filtre. Slutresultatet er, at fotoner med lavere energi i sondepulsen (dvs. den røde side af sondespektret) ankommer til prøven før fotoner med højere energi (dvs. den blå side af sondespektret). Dette resulterer i, at TA-spektrenes "tidsnul" smøres ud over flere femtosekunder eller picosekunder¹⁸, hvilket manifesterer sig som en tydelig kurve i det rå datasæt, der starter i de blå bølgelængder og derefter flader ud, når det nærmer sig det røde (supplerende figur 7). Chirp er mest mærkbar på kortere tidsskalaer som dem, der er adgang til med ultrahurtig TA. Denne bølgelængdeafhængige tid nul kan korrigeres som beskrevet i protokollen, men anvendelsen af denne proces kan være vanskelig og subjektiv. At have en "blank" prøve eller måling af opløsningsmidlets Kerr-respons kan minimere den subjektive karakter af håndplukkepunkter for den chirpkorrektion, der er nødvendig for at generere den polynomiske pasform, der bruges til at justere og korrigere kvidren. Målet med kvidrekorrektionen er at fjerne den tydelige "kurve" for tiden nul. Det kan tage flere forsøg på at tilpasse kvidren for at få de bedste kvidrekorrigerede data. Dataene kan tilpasses flere gange med forskellige chirpkorrektioner anvendt for at få en forståelse af den indvirkning, chirpkorrektionen har på værdierne af de korte TA-levetider.

Artefakter, der vises på "tid nul"
Flere artefakter kan observeres tæt på "tid nul" i TA-data, herunder Rayleigh-spredning, stimuleret Raman-spredning og tværfasemodulation. Rayleigh-spredning af pumpestrålen er elastisk spredning, der resulterer uden en ændring i energi. Denne funktion vises ved samme bølgelængde som pumpepulsen. Stimuleret Raman-spredning kan ledsage pumpens spredningssignal¹⁹. Ramanspredning, som skyldes uelastisk spredning af en pumpefoton, producerer toppe ved både højere (anti-Stokes) og lavere (Stokes) energi end den indfaldende pumpeenergi. I TA-data observeres stimuleret Raman-spredning på grund af samtidig bestråling af prøven med pumpe- og sondestrålerne. Når sondestrålen interagerer med prøven samtidig med pumpestrålen, stimulerer den Raman-processen. Derfor forekommer den stimulerede Raman-spredning omkring tid nul og resulterer i yderligere toppe i spektre inden for de første par hundrede femtosekunder (figur 6, observeret i det mørkere blå spektrum i det fremhævede område og supplerende figur 17). Tværfasemodulation stammer fra modulering af opløsningsmiddelbrydningsindekset fra interaktion med det intense elektriske felt af en puls.

Stimuleret Raman-spredning kan skelnes fra tværfasemodulation, fordi Raman-toppene vises ved specifikke frekvenser, der svarer til opløsningsmidlets vibrationstilstande. Fordi det er en Raman-proces, kan både Stokes- og anti-Stokes-linjer på hver side af excitationen observeres. Klorerede opløsningsmidler som methylenchlorid viser meget fremtrædende Raman-bånd på grund af klors store polariserbarhed. De spektrale signaturer af tværfasemodulation er unikke for et opløsningsmiddel, men forudsiges ikke så let som Raman-spredningsfunktioner.

Afhængigt af kinetikken i prøven, der måles, kan Rayleigh-spredning, Raman-spredning og tværfasemodulation overlappe med tidlige træk ved TA-dataene og kan være udfordrende at fjerne fra dataene. I princippet kan disse funktioner ses i en pæn opløsningsmiddelmåling og trækkes fra dataene, dataanalyseprogrammer kan have passende funktioner til at tage højde for disse funktioner, men i praksis kan dette være svært. Når det er for svært at trække disse artefakter fra uden at gå på kompromis med prøvedataene, kan det være bedre at beskære de kompromitterede spektre omkring tid nul for at eliminere artefakterne. Dette vil have den uheldige bivirkning at fjerne de første ca. 300 fs data, men vil gøre tilpasningen mere pålidelig senere. I løbet af analysen af flere datasæt af de samme og forskellige prøver får begynderen intuition til at opnå denne balance mellem at trække baggrundsoverfladen versus beskære de oprindelige 100-200 fs-data.

Generel beskæring kan være nødvendig for dele af spektrene, der indeholder lavt signal-til-støj. Ustabilitet i sondestrålen i visse områder, lav intensitet af sondelys, prøvekoncentrationer, der er for høje (derved blokerer meget af den indfaldende sonde), lav pumpeintensitet og absorptionstværsnittet af prøven er typiske syndere af lavt signal til støj, der kan gøre montering af data udfordrende. I disse tilfælde kan beskæring af datasættet på begge sider af det optiske vindue for at opnå et ønsket niveau af signal-støj-til-støj hjælpe tilpasningsprocessen.

Et datasæt er klar til analyse, når det er blevet tilstrækkeligt beskåret til at fjerne dårlige dele af datasættet, fået kvidren korrigeret og fået baggrundsspektre beregnet og trukket fra. Denne procedure bør resultere i data, der kun indeholder de dele, der er mest relevante for fotofysik og fotokemi af interesse. Det er faktisk klart, at der er en vis grad af subjektivitet i denne proces. Målet med dataforberedelse er at finde en balance mellem at fjerne artefakter, så de ikke forstyrrer tilpasningen, men ikke at fjerne så meget, at det kompromitterer datasættets integritet og derved hindrer dets fortolkning. At finde denne balance tager tid og erfaring at opbygge intuitionen for, hvad der er en artefakt, og hvad der er data. Tilpasning (og gentilpasning) af det samme datasæt på flere forskellige dage eller at have to forskere til at passe de samme data kan være en måde at minimere menneskelige fejl og subjektiviteten af dataforberedelse og analyse.

Generelle overvejelser vedrørende tilpasning og fortolkning
Efter at de rå TA-spektre er blevet behandlet, skal de fortolkes og modelleres for at udtrække information om arten og dynamikken i interessesystemet. Denne proces kan beskrives som en tretrinsprocedure, der omfatter indledende spektralfortolkning, kvantitativ modellering / tilpasning og tildeling af spektralfortolkningen til modellen / tilpasningen.

Indledende spektral fortolkning: I spektralfortolkningstrinnet er målet at tildele funktioner, der er til stede i TA-spektrene, til elektroniske tilstande, der er adgang til i systemets fotofysiske eller fotokemiske udvikling. Til at begynde med skal forskellige stater identificeres. I dette arbejde henviser stater til unikke elektroniske tilstande, der er en del af systemets fotofysiske eller fotokemiske udvikling. En tilstand, der for eksempel er repræsenteret ved en specifik potentiel energikurve (PEC), besidder et sæt karakteristiske toppe, der repræsenterer dets absorptionsspektrum. En ændring, der sker inden for en enkelt tilstand, kaldes en proces. En fotofysisk proces kan forekomme i TA-spektre som et topskift eller en ændring i spektrets bredde. Det centrale aspekt af en proces er, at statens befolkning forbliver den samme (dvs. processen sker inden for en given PEC); Det er fordelingen af energi inden for staten, der ændrer sig. En ændring i befolkningen i en stat vil blive omtalt som en overgang. Under en overgang udvikler systemet sig til en anden PEC (dvs. elektronisk tilstand). Overgange kan omfatte intern konvertering (IC), intersystemkrydsning (ISC), ladningsoverførsel, energioverførsel, dannelse af nye produkter eller tilbagevenden til jordtilstand. Retningslinjer for tildeling af tilstande, processer og overgange diskuteres i følgende afsnit.

Tildeling af stater
Det første trin i denne proces indebærer tildeling af spektrale egenskaber til specifikke kemiske arter eller tilstande. S_1-tilstanden i TA skal vise en levetid, der svarer til fluorescenslevetiden taget ved hjælp af tidsopløst emissionsspektroskopi. En triplettilstand kan verificeres, hvis dens levetid slukkes af ilt. Hvis der er mistanke om en radikal anion eller kation i den fotofysiske udvikling, kan spektroelektrokemi eller kemisk oxidation/reduktion udføres for at generere de radikale arter, og et absorptionsspektrum af denne art kan opnås og sammenlignes med TA-båndformen. Elektron spin resonans (ESR) spektroskopi kan udføres for at verificere tilstedeværelsen af frie radikaler. En fremragende tutorial talk hostet af ACS Division of Inorganic Chemistry giver et overblik over TA og sådanne overvejelser ved tildeling af funktioner²⁰. Efter at bånd er blevet tildelt arter, er det næste trin i fortolkningen af TA-spektre kvalitativt at beskrive de dynamiske processer, der forekommer i systemet. Dette trin er afgørende, da det giver forskeren en idé om, hvilke modeller der vil være passende til at beskrive deres system og vil give dem en baseline at sammenligne tilpasningsparametrene med.

Ændringer inden for en stat
Vibrationskøling, geometrisk omlejring eller solvation er ekstremt hurtige processer (sub-ps til 10's ps), der kan observeres med TA. Vibrationskøling observeres som hurtig blå forskydning af TA-spektret på en tidsskala på flere picosekunder 21,22,23. Geometrisk omlejring kan forekomme på 10's ps tidsskala. Solløsningsdynamik observeres som en rødforskydning og indsnævring af spektret over flere picosekunder i konventionelle dipolære væsker, men opløsningsmidler med høj viskositet såsom glycerol, polyethylenglycol (PEG), ioniske væsker og dybe eutektiske opløsningsmidler kan udvise opløsningsdynamik, der forekommer i løbet af flere nanosekunder 24,25,26.

Ændringer i en statsbefolkning
Reaktioner er kendetegnet ved en ændring i intensiteten af et bånd, hvor et fald i intensitet er forbundet med et fald i koncentrationen af dets kemiske arter og omvendt for en stigning. I nogle tilfælde er både reaktanten og produktarten synlige i spektrene, mens produkttilstandene i andre er for kortvarige eller for langt rødforskudte til at blive observeret. Ofte kan stat-til-stat-overgange observeres ved tilstedeværelsen af et isosbestisk punkt i spektrene.

Kvantitativ modellering / tilpasning: En model skal derefter være egnet til dataene for at udtrække kvantitativ information om systemets dynamik. Som tidligere beskrevet i indledningen er der et stort udvalg af modeller at bruge. Denne protokol fokuserer på to af de mest almindelige metoder: tilpasning med enkelt bølgelængde og global analyse. Enkeltbølgelængdemetoden involverer tilpasning af individuelle bølgelængdespor fra spektrene til en funktionel form, typisk en sum af eksponentialer:

(2)

hvor ΔA(t) er TA-signalet ved en valgt bølgelængde, n er antallet af eksponentielle komponenter, og a_ier amplituden af eksponentiel komponent, i, med tidskonstanten τ_i. Flere komponenter kan tilføjes, indtil tilpasningen gengiver de eksperimentelle data. Målet med enhver tilpasningsproces er at modellere dataene ved hjælp af nok levetider til at gengive dataene godt, men ikke overpasse dataene ved at inkludere for mange komponenter. Derfor bruges vægtede goodness-of-fit-parametre som f.eks. , til at hjælpe med at bestemme, hvornår dataene er egnede til inden for eksperimentelle usikkerheder⁵.

Når henfaldet er monteret tilfredsstillende, kan modellens parametre bruges til at karakterisere systemets dynamik. De resulterende tidskonstanter kan derefter ekstraheres og fortolkes. Desværre betyder det store antal overlappende træk i TA-spektre, at en enkelt bølgelængde i spektret kan indeholde dynamik svarende til forskellige arter, hvis spektrale signaturer overlapper hinanden, hvilket betyder, at tidskonstanterne ekstraheret fra en enkelt bølgelængdetilpasning kan repræsentere en sammensætning af flere sammenfaldende processer. Derudover vil eventuelle ændringer i båndform og position også påvirke amplituderne og tidskonstanterne ekstraheret fra enkeltbølgelængdetilpasning. Disse problemer kan i nogle tilfælde omgås ved hjælp af en passende metode kaldet 'båndformanalyse', hvor man bestemmer eller antager en funktionel form for TA-båndene for hver absorberende art i systemet. Disse former vægtes derefter med tidsafhængige amplituder og summeres sammen for at reproducere det observerede spektrum. Denne procedure anvendes almindeligvis til analyse af tidsopløste fluorescensspektre, men de mere komplicerede former og overlappende komponenter i TA-bånd gør denne metode kun holdbar i nogle få enkle tilfælde, som beskrevet andetsteds¹⁰.

En anden ulempe ved tilpasning med enkelt bølgelængde er, at den ikke i sig selv udnytter det brede spektralområde, som moderne TA-eksperimenter giver. Man kunne i princippet metodisk tilpasse hver enkelt bølgelængde af spektrene, men en sådan analyse er besværlig, tidskrævende og beregningsmæssigt dyr. For at bekæmpe denne udfordring kan en metode kaldet 'global analyse' bruges til samtidig at tilpasse et helt sæt TA-spektre til et sæt fælles dynamiske parametre⁴. Global analyse og en nært beslægtet metode kaldet målanalyse er vellykkede og udbredte metoder, men de kommer også med deres eget unikke sæt ulemper og begrænsninger. Som med enhver model er det bydende nødvendigt at forstå de antagelser, der bruges til at skabe den, såvel som de begrænsninger, de præsenterer.

I global analyse er TA-spektre repræsenteret af en m ved n matrix, hvor m repræsenterer antallet af bølgelængder målt i hvert spektrum og n repræsenterer antallet af indsamlede tidspunkter. Denne matrix antages derefter at kunne nedbrydes til produktet af to andre matricer:

(3)

hvor C(t) er en n ved k matrix og S(λ) er en m ved k matrix. Værdien k repræsenterer antallet af forskellige spektrale komponenter, der bruges til at reproducere spektrene. Hver af disse komponenter repræsenterer en absorberende art med en unik spektral signatur og dynamik. S(λ)-matricen repræsenterer k-komponenternes TA-spektre og C(t) deres tidsafhængige koncentrationer. I den enkleste og mest almindelige implementering af global analyse antages hver komponent at have enkelteksponentiel kinetik (i = 1 i ligning 2, hvor hver komponent tildeles sin egen tidskonstant). Sammenfattende kan det fulde TA-spektrum repræsenteres af summen af k-spektrakomponenter, hver med sit eget karakteristiske absorptionsspektrum og enkelt eksponentielt henfald.

Når TA-spektrene passer, gætter brugeren, hvor mange komponenter (dvs. en værdi for k) der er behov for, og gætter på tidskonstanten forbundet med et enkelt eksponentielt henfald af disse arter. Montøren genererer derefter C_gæt (t) og løser ligning 3 for S_fit (t). Dernæst ganges S_fit (λ) og C_guess (t) som i ligning 3 for at skabe de tilpassede spektre, ΔA (λ, t) _fit. Endelig minimeres resterne, ΔA(λ,t)_exp − A(λ,t)_fit, og den optimale_S-tilpasning(λ) og tidskonstanter returneres. Den relative enkelhed i global analyse, der repræsenterer et helt sæt spektre ved hjælp af en håndfuld tidskonstanter og faste spektrale komponenter, gør det til en attraktiv (og vellykket) metode til at løsne de komplicerede båndformer og dynamikker, der opstår i TA-spektroskopi. Man skal dog sørge for, at den samlede analyse er en passende model for det foreliggende system.

En nøgleantagelse i global analyse, illustreret i ligning 3, er den fuldstændige adskillelse af bølgelængde- og tidsdelene af dynamikken, en egenskab kaldet 'bilinearitet'. Denne antagelse kræver, at komponentbåndformerne er tidsuafhængige (dvs. de har en fast spektralform, der ikke varierer eller skifter med tiden). Det eneste, der ændrer sig under eksperimentet, er de relative populationer af hver komponent, repræsenteret af C (t). På lange tidsskalaer, ~ 1 ns eller deromkring, holder denne antagelse typisk, og global analyse kan bruges uden stor bekymring. På den anden side resulterer excited-state-processer såsom vibrationskøling og solvationsdynamik, fremtrædende på de ultrahurtige tidsskalaer, der er tilgængelige med femtosekund TA, i tidsafhængige ændringer i en arts spektrale signatur og en nedbrydning af bilinearitet. Dette betyder ikke, at global analyse ikke kan gengive et datasæt, faktisk kan det altid producere en tilfredsstillende pasform, forudsat at der anvendes et tilstrækkeligt antal komponenter. Problemet ligger så i at fortolke komponentspektrene og tildele tidskonstanterne til bestemte excited-state-processer, da komponenterne muligvis ikke længere svarer til forskellige absorberende arter. Derfor skal man altid være forsigtig, når man anvender global analyse på situationer, hvor bilinearitet ikke kan antages.

Tildeling af spektralfortolkningen til modellen/tilpasningen: Når en tilpasning er opnået, skal spektralfortolkningen kortlægges på de levetider, der opnås i tilpasningen. Levetiderne fra tilpasningen tildeles både processer og reaktioner, der blev identificeret i den oprindelige fortolkning af spektrene. Imidlertid er det ikke sikkert, at den indledende vurdering fra spektrene og antallet af tilpassede levetider, som modellen opnår, umiddelbart passer til hinanden. I denne (almindelige!) situation skal montøren gå tilbage og vurdere den oprindelige fortolkning. Måske var der en vibrationskøling eller anden proces, der blev savnet i den indledende vurdering, men blev identificeret i modellerings- og tilpasningsprocessen. Eller måske kan to forskellige sæt tilpasningsparametre gengive dataene godt, og den indledende fortolkning kan vejlede om, hvilket sæt tilpasningsparametre der vælges. I dette sidste trin skal montøren gå frem og tilbage mellem fortolkning og tilpasning for at finde en beskrivelse, der fører til en plausibel fotofysisk tildeling af systemets art og dynamik. Andre tilpasningsprogrammer, der omfatter sekventielle tilpasningsmodeller, såsom målanalyse, kan også undersøges for at supplere de tilpasninger, der opnås ved global analyse og tilpasningssoftwaren, der præsenteres i denne artikel⁴.

Sammenfattende diskuterer denne protokol forberedelse og tilpasning af forbigående absorptionsdata. Formålet er at fremhæve de udfordringer, der er forbundet med processen, og at kommentere på, hvordan disse udfordringer kan undgås eller afbødes på en praktisk måde. Tilpasning af TA-data, som tilpasning af de fleste data, der findes på tekniske områder, kan være vanskelig og til tider subjektiv. Derfor er det afgørende at være opmærksom på processen og begrænsningerne i dataene, dataforberedelsen og de matematiske værktøjer, der bruges til at modellere og tildele mening til dataene. Forskere skal nærme sig data og modellering med et kritisk øje.

Man kan forsøge at afbøde subjektiviteten af deres pasformer. For eksempel kan dataene udarbejdes og tilpasses fra forskellige udgangspunkter og på forskellige dage for at sikre, at den samme pasform produceres. Data taget på forskellige dage med forskellig prøveforberedelse kan sammenlignes. Flere forskere kan passe de samme data og sammenligne deres resultater. Over tid kan forskere opbygge en intuition om de data, de opnår (baseret på specifikationerne for deres eksperimentelle opsætning og eksperimentelle parametre), der giver dem mulighed for at være mere sikre på deres pasformer.

Der er meget at lære om TA-datatilpasning og detaljerne i de modeller, der diskuteres i denne artikel. Flere fremragende gennemgangsartikler anbefales entusiastisk, der dykker dybt ned i dette emne ^4,10,27. Denne protokol er beregnet til at være en nybegynders indgang til analyse- og tilpasningsprocessen, der ansporer interessen for dybere forståelse af processen.