Análisis de gotitas de lípidos teñidas con fluorescencia con reconstrucción 3D para la evaluación de la esteatosis hepática

Las gotas de lípidos (LD), clásicamente vistas como depósitos de energía, son orgánulos celulares especializados que median el almacenamiento de lípidos, y comprenden un núcleo lipídico neutro hidrófobo, que contiene principalmente ésteres de colesterol y triglicéridos (TG), encapsulados por una monocapa de fosfolípidos ^1,2,3.

La biogénesis de LD ocurre en el retículo endoplásmico (RE), comenzando con la síntesis de triacilglicerol (TAG) y ésteres de esteroles. Los lípidos neutros se difunden entre las valvas de la bicapa ER a bajas concentraciones, pero se unen en lentes de aceite que crecen y brotan en gotitas casi esféricas de la membrana ER cuando su concentración intracelular aumenta⁴. Posteriormente, las proteínas de la bicapa ER y el citosol, particularmente la familia de proteínas perilipina (PLIN), se translocan a las superficies de las LD para facilitar la gemación 5,6,7,8,9.

A través de la síntesis de nuevos ácidos grasos y la fusión o coalescencia de LD, los LD crecen en diferentes tamaños. En consecuencia, el tamaño y el número de LD difieren considerablemente entre los diferentes tipos de células. Las pequeñas gotas (300-800 nm de diámetro), que se conocen como LD iniciales (iLDs), pueden ser formadas por casi todas las células⁴. Más adelante en la formación de LD, la mayoría de las células son capaces de convertir algunos iLD en LD más grandes que se expanden (eLD >1 μm de diámetro). Sin embargo, solo tipos celulares específicos, como los adipocitos y los hepatocitos, tienen la capacidad de formar LD gigantes o de gran tamaño (hasta decenas de micras de diámetro)^4,10.

Las LD juegan un papel muy importante en la regulación del metabolismo lipídico celular, suprimiendo la lipotoxicidad y previniendo el estrés del RE, la disfunción mitocondrial y, en última instancia, la muerte celular causada por ácidos grasos libres (AF)^11,12,13,14. Además, las LD también han sido implicadas en la regulación de la expresión génica, el secuestro de proteínas de replicación viral y el tráfico y señalización de membranas^15,16,17. Por lo tanto, la mala regulación de la biogénesis de LD es un sello distintivo de las enfermedades crónicas asociadas con el síndrome metabólico, la obesidad, la diabetes mellitus tipo 2 (DM2) y / o la arteriosclerosis, por nombrar solo algunas 18,19,20.

El hígado, como centro metabólico, es el principal responsable del metabolismo de los lípidos mediante el almacenamiento y procesamiento de lípidos, y, por lo tanto, está constantemente amenazado por la lipotoxicidad²¹. La esteatosis hepática (HS) es una característica común de una serie de enfermedades hepáticas progresivas y se caracteriza por una acumulación excesiva de lípidos intracelulares en forma de LD citosólicas que, en última instancia, pueden conducir a disfunción metabólica hepática, inflamación y formas avanzadas de enfermedad del hígado graso no alcohólico^22,23,24,25. La HS ocurre cuando la tasa de oxidación de ácidos grasos y exportación como triglicéridos dentro de las lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL) es menor que la tasa de absorción de ácidos grasos hepáticos de la síntesis plasmática y de novo de ácidos grasos²⁶. La acumulación hepática de lípidos ocurre a menudo en dos formas, esteatosis microvesicular y macrovesicular, y éstas presentan características citoarquitectónicas distintas²⁷. Típicamente, la esteatosis microvesicular se caracteriza por la presencia de pequeñas LDs dispersas por todo el hepatocito con el núcleo colocado centralmente, mientras que la esteatosis macrovesicular se caracteriza por la presencia de una sola LD grande que ocupa la mayor parte del hepatocito, empujando el núcleo hacia la periferia^28,29. En particular, estos dos tipos de esteatosis a menudo se encuentran juntos, y no está claro cómo estos dos patrones de LD influyen en la patogénesis de la enfermedad, ya que la evidencia aún es inconsistente^31,32,33,34. Sin embargo, ese tipo de análisis se emplea a menudo como un “estándar de referencia” en estudios preclínicos y clínicos para comprender el comportamiento dinámico de los LD y caracterizar la esteatosis hepática 29,34,35,36.

Las biopsias hepáticas, el estándar de oro para diagnosticar y clasificar la HS, se evalúan rutinariamente mediante análisis histológico de hematoxilina y eosina (H&E), donde las gotitas de lípidos se evalúan como vacuolas no teñidas en secciones hepáticas teñidas con H&E³⁷. Aunque aceptable para la evaluación de la esteatosis macrovesicular, este tipo de tinción generalmente estrecha la evaluación de la esteatosis microvesicular³⁸. Los colorantes diazosolubles en lípidos, como Oil Red O (ORO), se combinan clásicamente con microscopía de campo claro para analizar las reservas de lípidos intracelulares, pero todavía tienen una serie de desventajas: (i) el uso de etanol o isopropanol en el proceso de tinción, que a menudo causa la interrupción de los LD nativos y la fusión ocasional a pesar de que las células están fijadas³⁹; ii) el carácter lento, ya que la solución ORO requiere la disolución y el filtrado del polvo fresco debido a la vida útil limitada, lo que contribuye a resultados menos consistentes; (iii) y el hecho de que ORO tiñe más que solo gotas lipídicas y a menudo sobreestima la esteatosis hepática³⁸.

En consecuencia, los fluoróforos lipofílicos permeables a las células, como el rojo del Nilo, se han utilizado en muestras vivas o fijas para superar algunas de las limitaciones antes mencionadas. Sin embargo, la naturaleza no específica del etiquetado de orgánulos lipídicos celulares reduce repetidamente las evaluaciones de LD⁴⁰. Además, las propiedades espectrales del Rojo del Nilo varían según la polaridad del medio ambiente, lo que a menudo puede conducir a cambios espectrales⁴¹.

La sonda fluorescente lipofílica 1,3,5,7,8-pentametil-4-bora-3a,4adiaza-s-indaceno (longitud de onda de excitación: 480 nm; emisión máxima: 515 nm; BODIPY 493/503) exhibe características de hidrofobicidad que permiten su rápida absorción por LD intracelular, se acumula en el núcleo de gotas lipídicas y, posteriormente, emite fluorescencia verde brillante¹². A diferencia del Nile Red, BODIPY 493/503 es insensible a la polaridad del entorno y se ha demostrado que es más selectivo, ya que muestra un alto brillo para imágenes LD. Para teñir LDs neutros, este colorante puede ser utilizado en células vivas o fijas y acoplado con éxito con otros métodos de tinción y/o etiquetado⁴². Otra ventaja del tinte es que requiere poco esfuerzo para colocarlo en una solución y es estable, eliminando así la necesidad de prepararlo recién para cada experimento⁴². A pesar de que la sonda BODIPY 493/503 se ha empleado con éxito para visualizar la localización y la dinámica de LD en cultivos celulares, algunos informes también han demostrado el uso confiable de este colorante como una herramienta de imagen LD en tejidos, incluido el músculo vasto lateral humano⁴³, el músculo sóleo de rata⁴² y el intestino de ratón⁴⁴.

En este documento, proponemos un protocolo optimizado basado en BODIPY 493/503 como un enfoque analítico alternativo para la evaluación del número, área y diámetro de LD en muestras hepáticas de un modelo animal de esteatosis hepática. Este procedimiento cubre la preparación de muestras de hígado, la sección de tejidos, las condiciones de tinción, la adquisición de imágenes y el análisis de datos.