간 지방증 평가를 위한 3D 재구성을 통한 형광 염색 지질 방울 분석

지질 방울(LD)은 일반적으로 에너지 저장소로 간주되며, 지질 저장을 매개하는 특수 세포 소기관이며, 인지질 단층 ^1,2,3에 의해 캡슐화된 콜레스테롤 에스테르와 트리글리세리드(TG)를 주로 포함하는 소수성 중성 지질 코어로 구성됩니다.

LD 생물 발생은 트리 아실 글리세롤 (TAG)과 스테롤 에스테르의 합성으로 시작하여 소포체 (ER)에서 발생합니다. 중성 지질은 낮은 농도에서 ER 이중층의 소엽 사이에서 확산되지만 세포 내 농도가 증가하면 ER 막에서 거의 구형의 물방울로 자라서 싹이 트는 오일 렌즈로 합쳐집니다⁴. 그 후, ER 이중층 및 세포질의 단백질, 특히 페리핀(PLIN) 단백질 패밀리는 LD의 표면으로 전위되어 출아를 촉진합니다 ^5,6,7,8,9.

새로운 지방산 합성과 LD 융합 또는 합체를 통해 LD는 다양한 크기로 성장합니다. 따라서 LD의 크기와 수는 세포 유형에 따라 상당히 다릅니다. 초기 LD(iLDs)로 알려진 작은 액적(직경 300-800 nm)은 거의 모든 세포에서 형성될 수 있다⁴. LD 형성 후반부에 대부분의 세포는 일부 iLD를 더 큰 iLD (eLD >직경 1μm)로 전환 할 수 있습니다. 그러나 지방 세포 및 간세포와 같은 특정 세포 유형만이 거대 또는 초대형 LD(직경이 최대 수십 미크^론)를 형성할 수 있는 능력을 가지고 있습니다^4,10.

LD는 세포 지질 대사의 조절, 지방 독성 억제, ER 스트레스, 미토콘드리아 기능 장애 및 궁극적으로 유리 지방산(FA)으로 인한 세포 사멸을 예방하는 데 매우 중요한 역할을 합니다11,12,13,14. 또한, LD는 또한 유전자 발현의 조절, 바이러스 복제 단백질 격리, 막 이동 및 신호 전달에 연루되어 있습니다^15,16,17. 따라서 LD 생물 발생의 잘못된 조절은 대사 증후군, 비만, 제2형 진성 당뇨병(T2DM) 및/또는 동맥경화와 관련된 만성 질환의 ^{특징입니다.}

간은 대사의 중심지로서 지질을 저장하고 처리함으로써 지질 대사를 주로 담당하기 때문에 지방 독성에 의해 지속적으로 위협을 받고 있다²¹. 간 지방증(HS)은 일련의 진행성 간 질환의 공통적인 특징이며 궁극적으로 간 대사 기능 장애, 염증 및 진행된 형태의 비알코올성 지방간 질환을 유발할 수 있는 세포질 LD의 형태로 과도한 세포 내 지질 축적을 특징으로 합니다^22,23,24,25. HS는 지방산 산화 및 트리글리세리드로 매우 저밀도 지단백질(VLDLs)로 내보내는 속도가 혈장 및 de novo 지방산 합성으로부터 간 지방산 흡수 속도보다 낮을 때 발생한다²⁶. 간 지질 축적은 종종 미세소포성 지방증과 대수포성 지방증의 두 가지 형태로 발생하며, 이들은 뚜렷한 세포구조학적 특성을 나타낸다²⁷. 전형적으로, 미세 소포 지방증은 핵이 중앙에 배치 된 간세포 전체에 분산 된 작은 LD의 존재를 특징으로하는 반면, 대대 소포 지방증은 간세포의 대부분을 차지하는 하나의 큰 LD의 존재를 특징으로하며, 핵을 주변으로 밀어 낸다^28,29. 특히, 이 두 가지 유형의 지방증은 종종 함께 발견되며, 증거가 여전히 일치하지 않기 때문에 이 두 가지 LD 패턴이 질병 발병에 어떻게 영향을 미치는지는 불분명합니다^31,32,33,34. 그러나 이러한 유형의 분석은 LD의 동적 거동을 이해하고 간 지방증을 특성화하기 위한 전임상 및 임상 연구에서 종종 “참조 표준”으로 사용됩니다 29,34,35,36.

HS 진단 및 등급을 매기기 위한 황금 표준인 간 생검은 조직학적 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 분석에 의해 일상적으로 평가되며, 여기서 지질 방울은 H&E 염색 간 섹션³⁷에서 염색되지 않은 액포로 평가됩니다. 대수포성 지방증 평가에는 허용되지만, 이러한 유형의 염색은 일반적으로 미세소포성 지방증의 평가를 좁힌다³⁸. ORO(Oil Red O)와 같은 지질 용해성 디아조 염료는 명시야 현미경과 결합하여 세포 내 지질 저장을 분석하지만, (i) 염색 과정에서 에탄올 또는 이소프로판올을 사용하면 세포가 고정되어 있음에도 불구하고 종종 천연 LD의 파괴와 간헐적인 융합을 유발합니다³⁹; (ii) ORO 용액은 제한된 저장 수명으로 인해 신선한 분말 용해 및 여과가 필요하기 때문에 시간이 많이 소요되어 덜 일관된 결과에 기여합니다. (iii) ORO가 단순한 지질 방울 이상을 염색하고 종종 간 지방증을 과대 평가한다는 사실³⁸.

결과적으로, 나일 레드(Nile Red)와 같은 세포 투과성 친유성 형광단은 앞서 언급한 한계 중 일부를 극복하기 위해 살아있는 샘플 또는 고정된 샘플에 사용되었습니다. 그러나, 세포 지질 소기관 표지의 비특이적 특성은 LD 평가를 반복적으로 좁힌다⁴⁰. 더욱이, 나일 레드의 스펙트럼 특성은 환경의 극성에 따라 달라지며, 이는 종종 스펙트럼 이동(⁴¹)으로 이어질 수 있다.

상기 친유성 형광 프로브는 1,3,5,7,8-펜타메틸-4-보라-3a,4adiaza-s-indacene (여기 파장: 480 nm; 최대 방출: 515 nm; BODIPY 493/503)은 세포 내 LD에 의한 빠른 흡수를 가능하게 하는 소수성 특성을 나타내며, 지질 액적 코어에 축적된 후 밝은 녹색 형광을 방출합니다¹². 나일 레드와 달리 BODIPY 493/503은 환경 극성에 민감하지 않으며 LD 이미징을 위해 높은 밝기를 표시하기 때문에 더 선택적인 것으로 나타났습니다. 중성 LD를 염색하기 위해, 이 염료는 살아있는 세포 또는 고정된 세포에서 사용될 수 있고, 다른 염색 및/또는 표지 방법(⁴²)과 성공적으로 결합될 수 있다. 염료의 또 다른 장점은 용액에 넣는 데 약간의 노력이 필요하고 안정하여 각 실험(⁴²)을 위해 새로 준비할 필요가 없다는 것이다. BODIPY 493/503 프로브가 세포 배양에서 LD의 국소화 및 역학을 시각화하는 데 성공적으로 사용되었지만, 일부 보고서에서는 인간 외측광근(⁴³), 쥐 가자미근(⁴²) 및 마우스 내장(⁴⁴)을 포함한 조직에서 LD 이미징 도구로서 이 염료를 신뢰할 수 있는 것으로 입증했습니다.

여기에서 우리는 간 지방증 동물 모델에서 간 표본의 LD 수, 면적 및 직경을 평가하기 위한 대체 분석 접근 방식으로 최적화된 BODIPY 493/503 기반 프로토콜을 제안합니다. 이 절차에는 간 샘플 준비, 조직 절개, 염색 조건, 이미지 획득 및 데이터 분석이 포함됩니다.