Analisi di goccioline lipidiche colorate con fluorescenza con ricostruzione 3D per la valutazione della steatosi epatica

Le goccioline lipidiche (LD), classicamente viste come depositi di energia, sono organelli cellulari specializzati che mediano l’accumulo di lipidi e comprendono un nucleo lipidico neutro idrofobico, che contiene principalmente esteri di colesterolo e trigliceridi (TG), incapsulati da un monostrato fosfolipidico ^1,2,3.

La biogenesi LD avviene nel reticolo endoplasmatico (ER), iniziando con la sintesi di triacilglicerolo (TAG) ed esteri sterolici. I lipidi neutri sono diffusi tra i lembi del doppio strato ER a basse concentrazioni, ma si fondono in lenti oleose che crescono e germogliano in goccioline quasi sferiche dalla membrana ER quando la loro concentrazione intracellulare aumenta⁴. Successivamente, le proteine del doppio strato ER e del citosol, in particolare la famiglia delle proteine perilipina (PLIN), traslocano sulle superfici delle LD per facilitare il germogliamento^di 5,6,7,8,9.

Attraverso la nuova sintesi degli acidi grassi e la fusione o la coalescenza delle LD, le LD crescono in diverse dimensioni. Di conseguenza, la dimensione e il numero di LD differiscono considerevolmente tra i diversi tipi di cellule. Piccole goccioline (300-800 nm di diametro), note come LD iniziali (iLD), possono essere formate da quasi tutte le cellule⁴. Più tardi nella formazione delle LD, la maggior parte delle cellule è in grado di convertire alcune iLD in LD più grandi che espandono (eLD >1 μm di diametro). Tuttavia, solo specifici tipi di cellule, come adipociti ed epatociti, hanno la capacità di formare LD giganti o sovradimensionati (fino a decine di micron di diametro)^4,10.

Le LD svolgono un ruolo molto importante nella regolazione del metabolismo lipidico cellulare, sopprimendo la lipotossicità e prevenendo lo stress ER, la disfunzione mitocondriale e, infine, la morte cellulare causata dagli acidi grassi liberi (FA)^11,12,13,14. Inoltre, le LD sono state anche implicate nella regolazione dell’espressione genica, nel sequestro delle proteine di replicazione virale e nel traffico e nella segnalazione di membrana^15,16,17. Pertanto, l’errata regolazione della biogenesi della LD è un segno distintivo delle malattie croniche associate alla sindrome metabolica, all’obesità, al diabete mellito di tipo 2 (T2DM) e / o all’arteriosclerosi, per citarne solo alcuni^18,19,20.

Il fegato, come hub metabolico, è principalmente responsabile del metabolismo lipidico immagazzinando ed elaborando i lipidi e, quindi, è costantemente minacciato dalla lipotossicitಹ. La steatosi epatica (HS) è una caratteristica comune di una serie di malattie epatiche progressive ed è caratterizzata da un eccessivo accumulo di lipidi intracellulari sotto forma di LD citosoliche che, in definitiva, possono portare a disfunzione metabolica epatica, infiammazione e forme avanzate di steatosi epatica non alcolica^22,23,24,25. L’HS si verifica quando il tasso di ossidazione ed esportazione degli acidi grassi come trigliceridi all’interno delle lipoproteine a bassissima densità (VLDL) è inferiore al tasso di assorbimento degli acidi grassi epatici dal plasma e dalla sintesi de novo degli acidi grassi²⁶. L’accumulo epatico di lipidi si presenta spesso in due forme – steatosi microvescicolare e macrovescicolare – e queste mostrano caratteristiche citoarchitettoniche distinte²⁷. Tipicamente, la steatosi microvescicolare è caratterizzata dalla presenza di piccole LD disperse in tutto l’epatocita con il nucleo posto centralmente, mentre la steatosi macrovescicolare è caratterizzata dalla presenza di un unico grande LD che occupa la maggior parte dell’epatocita, spingendo il nucleo verso la periferia^28,29. In particolare, questi due tipi di steatosi si trovano spesso insieme, e non è chiaro come questi due modelli LD influenzino la patogenesi della malattia, poiché le prove sono ancora incoerenti^31,32,33,34. Tuttavia, tale tipo di analisi è spesso impiegato come “standard di riferimento” negli studi preclinici e clinici per comprendere il comportamento dinamico delle LD e caratterizzare la steatosi epatica 29,34,35,36.

Le biopsie epatiche, il gold standard per la diagnosi e la classificazione dell’HS, sono valutate di routine mediante analisi istologica dell’ematossilina e dell’eosina (H & E), dove le goccioline lipidiche sono valutate come vacuoli non colorati nelle sezioni epatiche colorate con H & E³⁷. Sebbene accettabile per la valutazione della steatosi macrovescicolare, questo tipo di colorazione generalmente restringe la valutazione della steatosi microvescicolare³⁸. I coloranti diazo liposolubili, come Oil Red O (ORO), sono classicamente combinati con la microscopia a campo chiaro per analizzare le riserve lipidiche intracellulari, ma questi hanno ancora una serie di svantaggi: (i) l’uso di etanolo o isopropanolo nel processo di colorazione, che spesso causa l’interruzione delle LD native e la fusione occasionale nonostante le cellule siano fissate³⁹; ii) la natura dispendiosa in termini di tempo, in quanto la soluzione ORO richiede la dissoluzione e il filtraggio della polvere fresca a causa della limitata durata di conservazione, contribuendo così a risultati meno coerenti; (iii) e il fatto che ORO colora più di semplici goccioline lipidiche e spesso sovrastima la steatosi epatica³⁸.

Di conseguenza, i fluorofori lipofili permeabili alle cellule, come il rosso del Nilo, sono stati utilizzati in campioni vivi o fissi per superare alcune delle limitazioni di cui sopra. Tuttavia, la natura non specifica della marcatura degli organelli lipidici cellulari restringe ripetutamente le valutazioni LD⁴⁰. Inoltre, le proprietà spettrali del rosso Nilo variano a seconda della polarità dell’ambiente, che spesso può portare a spostamenti spettrali⁴¹.

La sonda fluorescente lipofila 1,3,5,7,8-pentametil-4-bora-3a,4adiaza-s-indacene (lunghezza d’onda di eccitazione: 480 nm; emissione massima: 515 nm; BODIPY 493/503) presenta caratteristiche di idrofobicità che ne consentono il rapido assorbimento da parte delle LD intracellulari, si accumula nel nucleo delle goccioline lipidiche e, successivamente, emette fluorescenza verde brillante¹². A differenza del Nilo Red, BODIPY 493/503 è insensibile alla polarità ambientale e ha dimostrato di essere più selettivo, in quanto mostra un’elevata luminosità per l’imaging LD. Al fine di colorare LD neutri, questo colorante può essere utilizzato in cellule vive o fisse e accoppiato con successo con altri metodi di colorazione e / o etichettatura⁴². Un altro vantaggio del colorante è che richiede poco sforzo per essere inserito in una soluzione ed è stabile, eliminando così la necessità di prepararlo fresco per ogni esperimento⁴². Anche se la sonda BODIPY 493/503 è stata impiegata con successo per visualizzare la localizzazione e la dinamica delle LD nelle colture cellulari, alcuni rapporti hanno anche dimostrato l’uso affidabile di questo colorante come strumento di imaging LD in tessuti tra cui il muscolo del vasto laterale umano⁴³, il muscolo soleo del ratto 42 e l’intestino del topo⁴⁴.

Qui, proponiamo un protocollo ottimizzato basato su BODIPY 493/503 come approccio analitico alternativo per la valutazione del numero, dell’area e del diametro LD in campioni di fegato da un modello animale di steatosi epatica. Questa procedura copre la preparazione del campione di fegato, il sezionamento dei tessuti, le condizioni di colorazione, l’acquisizione di immagini e l’analisi dei dati.