Summary

Vascularização Eficiente de Organoides Renais através do Transplante Intracelomico em Embriões de Galinha

Published: February 17, 2023
doi:

Summary

Apresentamos aqui um protocolo detalhado para o transplante de organoides renais na cavidade celômica de embriões de galinha. Este método induz a vascularização e maior maturação dos organoides em 8 dias e pode ser usado para estudar esses processos de maneira eficiente.

Abstract

Os organoides renais derivados de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos contêm estruturas semelhantes a néfrons que se assemelham às do rim adulto até certo ponto. Infelizmente, sua aplicabilidade clínica é dificultada pela falta de uma vasculatura funcional e, consequentemente, maturação limitada in vitro. O transplante de organoides renais na cavidade celômica de embriões de galinha induz a vascularização por vasos sanguíneos perfundidos, incluindo a formação de capilares glomerulares, e aumenta sua maturação. Esta técnica é muito eficiente, permitindo o transplante e análise de um grande número de organoides. Este trabalho descreve um protocolo detalhado para o transplante intracelomico de organoides renais em embriões de galinha, seguido da injeção de lectina fluorescentemente marcada para coloração da vasculatura perfundida e da coleta de organoides transplantados para análise de imagem. Este método pode ser usado para induzir e estudar a vascularização e maturação de organoides para encontrar pistas para melhorar esses processos in vitro e melhorar a modelagem de doenças.

Introduction

Organoides renais derivados de células-tronco pluripotentes induzidas humanas (hiPSC) têm demonstrado potencial para estudos de desenvolvimento 1,2,3,4, triagem de toxicidade 5,6 e modelagem de doenças5,7,8,9,10,11,12,13. Entretanto, sua aplicabilidade para esses e eventuais transplantes clínicos é limitada pela falta de uma rede vascular. Durante o desenvolvimento renal embrionário, podócitos, células mesangiais e células endoteliais vasculares (CEs) interagem para formar a intrincada estrutura do glomérulo. Sem essa interação, a barreira de filtração glomerular, composta por podócitos, membrana basal glomerular (MBG) e CE, não pode se desenvolver adequadamente14,15,16. Embora os organoides renais in vitro contenham algumas CE, estas não formam uma rede vascular adequada e diminuem com o passar do tempo17. Portanto, não é surpreendente que os organoides permaneçam imaturos. O transplante em camundongos induz vascularização e maturação dos organoides renais 18,19,20,21. Infelizmente, este é um processo trabalhoso que é inadequado para a análise de um grande número de organoides.

Embriões de galinha têm sido utilizados para estudar vascularização e desenvolvimento há mais de um século22. São de fácil acesso, requerem baixa manutenção, não possuem sistema imunológico totalmente funcional e podem desenvolver-se normalmente após a abertura da casca do ovo23,24,25,26. Demonstrou-se que o transplante de organoides em sua membrana corioalantóide (CAM) leva à vascularização27. No entanto, a duração do transplante na MAC, bem como o nível de maturação do enxerto, são limitados pela formação de CAM, que leva até o 7º dia embrionário para ser concluída. Portanto, recentemente foi desenvolvido um método para vascularizar eficientemente e amadurecer organoides renais através do transplante intracelomico em embriões degalinha28. A cavidade celômica de embriões de galinha é conhecida desde a década de 1930 como um ambiente favorável para a diferenciação de tecidos embrionários29,30. Pode ser acessado no início do desenvolvimento embrionário e permite a expansão relativamente ilimitada do enxerto em todas as direções.

Este trabalho descreve um protocolo para o transplante de organoides renais derivados de hiPSC na cavidade celômica de embriões de galinha do dia 4. Este método induz vascularização e maior maturação dos organoides em 8 dias. A injeção de aglutinina culinaris fluorescentemente marcada (LCA) antes do sacrifício dos embriões permite a visualização dos vasos sanguíneos perfundidos dentro dos organoides através da microscopia confocal.

Protocol

De acordo com a legislação holandesa, a aprovação do comitê de bem-estar animal não era necessária para esta pesquisa. 1. Preparação de organoides renais derivados da hiPSC para transplante Diferenciar hiPSCs de organoides renais utilizando o protocolo desenvolvido por Takasato et al.4,18,31. Cultura dos organoides seguindo este protocolo em pastilhas de cultura cel…

Representative Results

O método e o cronograma para diferenciação de hiPSCs em organoides renais, incubação de ovos de galinha fertilizados, transplante de organoides renais, injeção de ACV e coleta dos organoides estão resumidos na Figura 1A. É importante coordenar o momento da diferenciação organoide e incubação dos ovos de galinha, iniciando a diferenciação 15 dias antes da incubação. As ações nos dias 0, 3, 4 e 12 de incubação são ilustradas por fotografias abaixo da linha do tempo. Os o…

Discussion

Neste manuscrito, um protocolo para transplante intracelomico de organoides renais derivados de hiPSC em embriões de galinha é demonstrado. Após o transplante, os organoides são vascularizados por vasos sanguíneos perfundidos que consistem em uma combinação de CE derivada de organoides humanos e de frango. Estes se espalham por todo o organoide e invadem as estruturas glomerulares, possibilitando a interação entre as CE e os podócitos. Foi demonstrado anteriormente que isso leva a uma maior maturação das estr…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos a George Galaris (LUMC, Leiden, Holanda) por sua ajuda com a injeção de embrião de galinha. Agradecemos o apoio de Saskia van der Wal-Maas (Department of Anatomy &Embryology, LUMC, Leiden, Holanda), Conny van Munsteren (Department of Anatomy & Embryology, LUMC, Leiden, Holanda), Manon Zuurmond (LUMC, Leiden, Holanda) e Annemarie de Graaf (LUMC, Leiden, Holanda). M. Koning é apoiado por «Nephrosearch Stichting tot steun van het wetenschappelijk onderzoek van de afdeling Nierziekten van het LUMC». Este trabalho foi em parte apoiado pelo Leiden University Fund “Prof. Jaap de Graeff-Lingling Wiyadhanrma Fund” GWF2019-02. Este trabalho é apoiado pelos parceiros da Regenerative Medicine Crossing Borders (RegMedXB) e Health Holland, Top Sector Life Sciences and Health. C.W. van den Berg e T.J. Rabelink são apoiados pelo Centro da Fundação Novo Nordisk para Medicina de Células-Tronco (reNEW), O Centro da Fundação Novo Nordisk para Medicina de Células-Tronco é apoiado por subsídios da Fundação Novo Nordisk (NNF21CC0073729).

Materials

0.2 µm filter: Whatman Puradisc 30 syringe filter 0.2 µm Whatman 10462200
35 mm glass bottom dishes  MatTek Corporation P35G-1.5-14-C
Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes Sigma-Aldrich A5177-5EA Contains silicone tubes, mouth piece and connector
Confocal microscope: Leica White Light Laser Confocal Microscope  Leica TCS SP8
Dissecting forceps, simple type. Titanium, curved, with fine sharp tips Hammacher Karl HAMMHTC091-10
Dissecting forceps, simple type. Titanium, straight, with fine sharp tips Hammacher Karl HAMMHTC090-11
Dissecting microscope  Wild Heerbrugg 355110
Dissecting scissors, curved, OP-special, extra sharp/sharp Hammacher Karl HAMMHSB391-10
Donkey serum Sigma-Aldrich D9663
Donkey-α-mouse Alexa Fluor 488 ThermoFisher Scientific A-212-02 dilution 1:500
Donkey-α-sheep Alexa Fluor 647 ThermoFisher Scientific A-21448 dilution 1:500
Double edged stainless steel razor blades Electron Microsopy Sciences 72000
DPBS, calcium, magnesium (DPBS-/-) ThermoFisher Scientific 14040133
DPBS, no calcium, no magnesium (DPBS+/+) ThermoFisher Scientific 14190094
Egg cartons or custom made egg holders  NA NA
Fertilized white leghorn eggs (Gallus Gallus Domesticus Drost Loosdrecht B.V. NA
Incubator Elbanton BV ET-3 combi
Lotus Tetragonolobus lectin (LTL) Biotinylated Vector Laboratories B-1325 dilution 1:300
Micro scissors, straight, sharp/sharp, cutting length 10 mm Hammacher Karl HAMMHSB500-09
Microcapillaries: Thin wall glass capillaries 1.5 mm, filament World Precision Instruments TW150F-3
Micropipette puller Sutter Instrument Company Model P-97 We use the following settings: Heat 533, Pull 60, Velocity 150, Time 200
Microscalpel holder: Castroviejo blade and pins holder, 12 cm, round handle, conical 10 mm jaws. Euronexia L-120
Mounting medium: Prolong Gold Antifade Mountant  ThermoFisher Scientific P36930
Olivecrona dura dissector 18 cm  Reda 41146-18
Parafilm  Heathrow Scientific HS234526B
Penicillin-streptomycin 5,000 U/mL ThermoFisher Scientific 15070063
Perforated spoon  Euronexia S-20-P
Petri dish 60 x 15 mm  CELLSTAR 628160
Plastic transfer pipettes  ThermoFisher Scientific PP89SB
Purified mouse anti-human CD31 antibody BD Biosciences 555444 dilution 1:100
Rhodamine labeled Lens Culinaris Agglutinin (LCA) Vector Laboratories RL-1042 This product has recently been discontinued. Vectorlabs does still produce Dylight 649 labeled LCA (DL-1048-1) and fluorescein labeled LCA (FL-1041-5)
Sheep anti-human NPHS1 antibody R&D systems AF4269 dilution 1:100
Sterile hypodermic needles, 19 G BD microlance 301500
Streptavidin Alexa Fluor 405 ThermoFisher Scientific S32351 dilution 1:200
Syringe 5 mL BD Emerald 307731
Transparent tape  Tesa 4124 Available at most hardware stores
Triton X Sigma-Aldrich T9284
Tungsten wire, 0.25 mm dia  ThermoFisher Scientific 010404.H2

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Koning, M., Lievers, E., Jaffredo, T., van den Berg, C. W., Rabelink, T. J. Efficient Vascularization of Kidney Organoids through Intracelomic Transplantation in Chicken Embryos. J. Vis. Exp. (192), e65090, doi:10.3791/65090 (2023).

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