Effiziente Vaskularisierung von Nierenorganoiden durch intracelome Transplantation in Hühnerembryonen
Summary
In dieser Arbeit stellen wir ein detailliertes Protokoll für die Transplantation von Nierenorganoiden in die Zölomhöhle von Hühnerembryonen vor. Diese Methode induziert eine Vaskularisierung und eine verbesserte Reifung der Organoide innerhalb von 8 Tagen und kann verwendet werden, um diese Prozesse auf effiziente Weise zu untersuchen.
Abstract
Nierenorganoide, die aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen gewonnen werden, enthalten nephronähnliche Strukturen, die denen in der erwachsenen Niere bis zu einem gewissen Grad ähneln. Leider wird ihre klinische Anwendbarkeit durch das Fehlen eines funktionellen Gefäßsystems und die daraus resultierende eingeschränkte Reifung in vitro erschwert. Die Transplantation von Nierenorganoiden in die Zölomhöhle von Hühnerembryonen induziert die Vaskularisierung durch perfundierte Blutgefäße, einschließlich der Bildung glomerulärer Kapillaren, und fördert deren Reifung. Diese Technik ist sehr effizient und ermöglicht die Transplantation und Analyse einer großen Anzahl von Organoiden. Diese Arbeit beschreibt ein detailliertes Protokoll für die intracelome Transplantation von Nierenorganoiden in Hühnerembryonen, gefolgt von der Injektion von fluoreszenzmarkiertem Lektin zur Färbung des perfundierten Gefäßsystems und der Entnahme von transplantierten Organoiden für die bildgebende Analyse. Diese Methode kann verwendet werden, um die Organoid-Vaskularisierung und -Reifung zu induzieren und zu untersuchen, um Hinweise zur Verbesserung dieser Prozesse in vitro zu finden und die Krankheitsmodellierung zu verbessern.
Introduction
Es hat sich gezeigt, dass aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSC) gewonnenen Nierenorganoiden Potenzial für Entwicklungsstudien 1,2,3,4, Toxizitätsscreening 5,6 und Krankheitsmodellierung5,7,8,9,10,11,12,13 haben. Ihre Anwendbarkeit für diese und spätere klinische Transplantationszwecke ist jedoch durch das Fehlen eines vaskulären Netzwerks eingeschränkt. Während der embryonalen Nierenentwicklung interagieren Podozyten, Mesangialzellen und vaskuläre Endothelzellen (ECs), um die komplizierte Struktur des Glomerulus zu bilden. Ohne diese Wechselwirkung kann sich die glomeruläre Filtrationsbarriere, bestehend aus Podozyten, der glomerulären Basalmembran (GBM) und ECs, nicht richtig entwickeln14,15,16. Obwohl Nierenorganoide in vitro einige ECs enthalten, bilden diese kein richtiges Gefäßnetzwerk und nehmen mit der Zeit ab17. Es ist daher nicht verwunderlich, dass die Organoide unreif bleiben. Die Transplantation in Mäusen induziert eine Vaskularisierung und Reifung der Nierenorganoide 18,19,20,21. Leider ist dies ein arbeitsintensiver Prozess, der für die Analyse einer großen Anzahl von Organoiden ungeeignet ist.
Hühnerembryonen werden seit über einem Jahrhundert verwendet, um die Vaskularisierung und Entwicklung zu untersuchen22. Sie sind leicht zugänglich, wartungsarm, verfügen nicht über ein voll funktionsfähiges Immunsystem und können sich nach dem Öffnen der Eierschale normal entwickeln23,24,25,26. Es konnte gezeigt werden, dass die Transplantation von Organoiden auf deren chorioallantoische Membran (CAM) zu einer Vaskularisation führt27. Die Dauer der Transplantation auf dem CAM sowie der Reifegrad des Transplantats sind jedoch durch die CAM-Bildung begrenzt, die bis zum 7. Embryonaltag dauert. Daher wurde kürzlich eine Methode entwickelt, um Nierenorganoide durch intracelome Transplantation in Hühnerembryonen effizient zu vaskularisieren und reifenzu lassen 28. Seit den 1930er Jahren ist bekannt, dass die Zölomhöhle von Hühnerembryonen eine günstige Umgebung für die Differenzierung von embryonalem Gewebedarstellt 29,30. Es ist früh in der Embryonalentwicklung zugänglich und ermöglicht eine relativ unbegrenzte Ausdehnung des Transplantats in alle Richtungen.
In dieser Arbeit wird ein Protokoll für die Transplantation von hiPSC-abgeleiteten Nierenorganoiden in die Zölomhöhle von Tag-4-Hühnerembryonen beschrieben. Diese Methode induziert eine Vaskularisierung und eine verbesserte Reifung der Organoide innerhalb von 8 Tagen. Die Injektion von fluoreszenzmarkiertem Lens culinaris Agglutinin (LCA) vor der Opferung der Embryonen ermöglicht die Visualisierung von perfundierten Blutgefäßen in den Organoiden durch konfokale Mikroskopie.
Protocol
Representative Results
Discussion
In diesem Manuskript wird ein Protokoll für die intracelome Transplantation von hiPSC-abgeleiteten Nierenorganoiden in Hühnerembryonen demonstriert. Nach der Transplantation werden Organoide durch perfundierte Blutgefäße vaskularisiert, die aus einer Kombination von aus menschlichen Organoiden und Hühnern bestehen. Diese verteilen sich über das Organoid und dringen in die glomerulären Strukturen ein, was eine Wechselwirkung zwischen den ECs und Podozyten ermöglicht. Es konnte bereits gezeigt werden, dass dies zu …
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken George Galaris (LUMC, Leiden, Niederlande) für seine Hilfe bei der Injektion von Hühnerembryonen. Wir bedanken uns für die Unterstützung von Saskia van der Wal-Maas (Institut für Anatomie und Embryologie, LUMC, Leiden, Niederlande), Conny van Munsteren (Institut für Anatomie und Embryologie, LUMC, Leiden, Niederlande), Manon Zuurmond (LUMC, Leiden, Niederlande) und Annemarie de Graaf (LUMC, Leiden, Niederlande). M. Koning wird unterstützt von “Nephrosearch Stichting tot steun van het wetenschappelijk onderzoek van de afdeling Nierziekten van het LUMC”. Diese Arbeit wurde zum Teil durch den Fonds der Universität Leiden “Prof. Jaap de Graeff-Lingling Wiyadhanrma Fund” GWF2019-02 unterstützt. Diese Arbeit wird von den Partnern Regenerative Medicine Crossing Borders (RegMedXB) und Health Holland, Top Sector Life Sciences &; Health unterstützt. C.W. van den Berg und T.J. Rabelink werden vom Novo Nordisk Foundation Center for Stem Cell Medicine (reNEW) unterstützt, das Novo Nordisk Foundation Center for Stem Cell Medicine wird durch Zuschüsse der Novo Nordisk Foundation unterstützt (NNF21CC0073729).
Materials
| 0.2 µm filter: Whatman Puradisc 30 syringe filter 0.2 µm | Whatman | 10462200 | |
| 35 mm glass bottom dishes | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C | |
| Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes | Sigma-Aldrich | A5177-5EA | Contains silicone tubes, mouth piece and connector |
| Confocal microscope: Leica White Light Laser Confocal Microscope | Leica | TCS SP8 | |
| Dissecting forceps, simple type. Titanium, curved, with fine sharp tips | Hammacher Karl | HAMMHTC091-10 | |
| Dissecting forceps, simple type. Titanium, straight, with fine sharp tips | Hammacher Karl | HAMMHTC090-11 | |
| Dissecting microscope | Wild Heerbrugg | 355110 | |
| Dissecting scissors, curved, OP-special, extra sharp/sharp | Hammacher Karl | HAMMHSB391-10 | |
| Donkey serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| Donkey-α-mouse Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-212-02 | dilution 1:500 |
| Donkey-α-sheep Alexa Fluor 647 | ThermoFisher Scientific | A-21448 | dilution 1:500 |
| Double edged stainless steel razor blades | Electron Microsopy Sciences | 72000 | |
| DPBS, calcium, magnesium (DPBS-/-) | ThermoFisher Scientific | 14040133 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium (DPBS+/+) | ThermoFisher Scientific | 14190094 | |
| Egg cartons or custom made egg holders | NA | NA | |
| Fertilized white leghorn eggs (Gallus Gallus Domesticus) | Drost Loosdrecht B.V. | NA | |
| Incubator | Elbanton BV | ET-3 combi | |
| Lotus Tetragonolobus lectin (LTL) Biotinylated | Vector Laboratories | B-1325 | dilution 1:300 |
| Micro scissors, straight, sharp/sharp, cutting length 10 mm | Hammacher Karl | HAMMHSB500-09 | |
| Microcapillaries: Thin wall glass capillaries 1.5 mm, filament | World Precision Instruments | TW150F-3 | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument Company | Model P-97 | We use the following settings: Heat 533, Pull 60, Velocity 150, Time 200 |
| Microscalpel holder: Castroviejo blade and pins holder, 12 cm, round handle, conical 10 mm jaws. | Euronexia | L-120 | |
| Mounting medium: Prolong Gold Antifade Mountant | ThermoFisher Scientific | P36930 | |
| Olivecrona dura dissector 18 cm | Reda | 41146-18 | |
| Parafilm | Heathrow Scientific | HS234526B | |
| Penicillin-streptomycin 5,000 U/mL | ThermoFisher Scientific | 15070063 | |
| Perforated spoon | Euronexia | S-20-P | |
| Petri dish 60 x 15 mm | CELLSTAR | 628160 | |
| Plastic transfer pipettes | ThermoFisher Scientific | PP89SB | |
| Purified mouse anti-human CD31 antibody | BD Biosciences | 555444 | dilution 1:100 |
| Rhodamine labeled Lens Culinaris Agglutinin (LCA) | Vector Laboratories | RL-1042 | This product has recently been discontinued. Vectorlabs does still produce Dylight 649 labeled LCA (DL-1048-1) and fluorescein labeled LCA (FL-1041-5) |
| Sheep anti-human NPHS1 antibody | R&D systems | AF4269 | dilution 1:100 |
| Sterile hypodermic needles, 19 G | BD microlance | 301500 | |
| Streptavidin Alexa Fluor 405 | ThermoFisher Scientific | S32351 | dilution 1:200 |
| Syringe 5 mL | BD Emerald | 307731 | |
| Transparent tape | Tesa | 4124 | Available at most hardware stores |
| Triton X | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Tungsten wire, 0.25 mm dia | ThermoFisher Scientific | 010404.H2 |
Referenzen
- Taguchi, A., et al. Redefining the in vivo origin of metanephric nephron progenitors enables generation of complex kidney structures from pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 14 (1), 53-67 (2014).
- Morizane, R., et al. Nephron organoids derived from human pluripotent stem cells model kidney development and injury. Nature Biotechnology. 33 (11), 1193-1200 (2015).
- Kim, Y. K., et al. Gene-edited human kidney organoids reveal mechanisms of disease in podocyte development. Stem Cells. 35 (12), 2366-2378 (2017).
- Takasato, M., et al. Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis. Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).
- Hale, L. J., et al. 3D organoid-derived human glomeruli for personalised podocyte disease modelling and drug screening. Nature Communications. 9 (1), 5167 (2018).
- Vanslambrouck, J. M., et al. Enhanced metanephric specification to functional proximal tubule enables toxicity screening and infectious disease modelling in kidney organoids. Nature Communications. 13 (1), 5943 (2022).
- Tanigawa, S., et al. Organoids from nephrotic disease-derived iPSCs identify impaired NEPHRIN localization and slit diaphragm formation in kidney podocytes. Stem Cell Reports. 11 (3), 727-740 (2018).
- Forbes, T. A., et al. Patient-iPSC-derived kidney organoids show functional validation of a ciliopathic renal phenotype and reveal underlying pathogenetic mechanisms. American Journal of Human Genetics. 102 (5), 816-831 (2018).
- Freedman, B. S., et al. Modelling kidney disease with CRISPR-mutant kidney organoids derived from human pluripotent epiblast spheroids. Nature Communications. 6, 8715 (2015).
- Cruz, N. M., et al. Organoid cystogenesis reveals a critical role of microenvironment in human polycystic kidney disease. Nature Materials. 16 (11), 1112-1119 (2017).
- Gupta, N., et al. Modeling injury and repair in kidney organoids reveals that homologous recombination governs tubular intrinsic repair. Science Translational Medicine. 14 (634), eabj4772 (2022).
- Hiratsuka, K., et al. Organoid-on-a-chip model of human ARPKD reveals mechanosensing pathomechanisms for drug discovery. Scencei Advances. 8 (38), eabq0866 (2022).
- Dorison, A., et al. Kidney organoids generated using an allelic series of NPHS2 point variants reveal distinct intracellular podocin mistrafficking. Journal of the American Society of Nephrology. , (2022).
- Eremina, V., et al. Glomerular-specific alterations of VEGF-A expression lead to distinct congenital and acquired renal diseases. The Journal of Clinical Investigation. 111 (5), 707-716 (2003).
- Kitamoto, Y., Tokunaga, H., Tomita, K. Vascular endothelial growth factor is an essential molecule for mouse kidney development: glomerulogenesis and nephrogenesis. The Journal of Clinical Investigation. 99 (10), 2351-2357 (1997).
- Sison, K., et al. Glomerular structure and function require paracrine, not autocrine, VEGF-VEGFR-2 signaling. Journal of the American Society of Nephrology. 21 (10), 1691-1701 (2010).
- Ryan, A. R., et al. Vascular deficiencies in renal organoids and ex vivo kidney organogenesis. Entwicklungsbiologie. 477, 98-116 (2021).
- vanden Berg, C. W., et al. Renal subcapsular transplantation of PSC-derived kidney organoids induces neo-vasculogenesis and significant glomerular and tubular maturation in vivo. Stem Cell Reports. 10 (3), 751-765 (2018).
- Sharmin, S., et al. Human induced pluripotent stem cell-derived podocytes mature into vascularized glomeruli upon experimental transplantation. Journal of the American Society of Nephrology. 27 (6), 1778-1791 (2016).
- Bantounas, I., et al. Generation of functioning nephrons by implanting human pluripotent stem cell-derived kidney progenitors. Stem Cell Reports. 10 (3), 766-779 (2018).
- vanden Berg, C. W., Koudijs, A., Ritsma, L., Rabelink, T. J. In vivo assessment of size-selective glomerular sieving in transplanted human induced pluripotent stem cell-derived kidney organoids. Journal of the American Society of Nephrology. 31 (5), 921-929 (2020).
- Asai, R., Bressan, M., Mikawa, T. Avians as a model system of vascular development. Methods in Molecular Biology. 2206, 103-127 (2021).
- Jankovic, B. D., et al. Immunological capacity of the chicken embryo. I. Relationship between the maturation of lymphoid tissues and the occurrence of cell-mediated immunity in the developing chicken embryo. Immunology. 29 (3), 497-508 (1975).
- Alkie, T. N., et al. Development of innate immunity in chicken embryos and newly hatched chicks: a disease control perspective. Avian Pathology. 48 (4), 288-310 (2019).
- Rawles, M. E. Transplantation of normal embryonic tissues. Annalls of the New York Academy of Sciences. 55 (2), 302-312 (1952).
- Rawles, M. E. The development of melanophores from embryonic mouse tissues grown in the coelom of chick embryos. Proceedings of the National Academy of Sciences. 26 (12), 673-680 (1940).
- Garreta, E., et al. Fine tuning the extracellular environment accelerates the derivation of kidney organoids from human pluripotent stem cells. Nature Materials. 18 (4), 397-405 (2019).
- Koning, M., et al. Vasculogenesis in kidney organoids upon transplantation. NPJ Regenerative Medicine. 7 (1), 40 (2022).
- Hamburger, V. Morphogenetic and axial self-differentiation of transplanted limb primordia of 2-day chick embryos. Journal of Experimental Zoology. 77 (3), 379-399 (1938).
- Dossel, W. E. New method of intracelomic grafting. Science. 120 (3111), 262-263 (1954).
- Takasato, M., Er, P. X., Chiu, H. S., Little, M. H. Generation of kidney organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 11 (9), 1681-1692 (2016).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Developmental Dynamics. 195 (4), 231-272 (1992).
- Aleksandrowicz, E., Herr, I. Ethical euthanasia and short-term anesthesia of the chick embryo. ALTEX. 32 (2), 143-147 (2015).
- . ACUC. Guideline: The Use and Euthanasia Procedures of Chicken/Avian Embryos. , (2012).
