닭 배아에서 Intracelomic Transplantation을 통한 신장 오가노이드의 효율적인 혈관 형성
Summary
여기에서 우리는 닭 배아의 celomic cavity에서 신장 오가노이드의 이식을 위한 자세한 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 8일 이내에 오가노이드의 혈관 형성 및 성숙 향상을 유도하고 이러한 과정을 효율적인 방식으로 연구하는 데 사용할 수 있습니다.
Abstract
인간 유도 만능 줄기 세포에서 유래한 신장 오가노이드는 성인 신장의 것과 어느 정도 유사한 네프론 유사 구조를 포함합니다. 불행하게도, 그들의 임상적 적용 가능성은 기능적 맥관 구조의 부족과 결과적으로 시험관 내 성숙이 제한되어 방해를 받습니다. 닭 배아의 celomic cavity에 신장 오가노이드를 이식하면 사구체 모세 혈관 형성을 포함하여 관류 된 혈관에 의한 혈관 형성을 유도하고 성숙을 향상시킵니다. 이 기술은 매우 효율적이어서 많은 수의 오가노이드를 이식하고 분석할 수 있습니다. 이 논문은 닭 배아에서 신장 오가노이드의 뇌내 이식에 대한 자세한 프로토콜을 설명한 후 관류된 혈관 구조를 염색하기 위해 형광 표지된 렉틴을 주입하고 이미징 분석을 위해 이식된 오가노이드를 수집합니다. 이 방법은 오가노이드 혈관화 및 성숙을 유도 및 연구하여 시험관 내에서 이러한 과정을 향상시키고 질병 모델링을 개선하기 위한 단서를 찾는 데 사용할 수 있습니다.
Introduction
인간 유도만능줄기세포(hiPSC) 유래 신장 오가노이드는 발달 연구 1,2,3,4, 독성 스크리닝 5,6 및 질병 모델링5,7,8,9,10,11,12,13에 대한 잠재력이 있는 것으로 나타났습니다 . 그러나 이러한 목적 및 궁극적인 임상 이식 목적에 대한 적용 가능성은 혈관 네트워크의 부족으로 인해 제한됩니다. 배아 신장 발달 동안 족세포, 간질 세포 및 혈관 내피 세포(EC)가 상호 작용하여 사구체의 복잡한 구조를 형성합니다. 이러한 상호 작용이 없으면 족세포, 사구체 기저막(GBM) 및 EC로 구성된 사구체 여과 장벽이 제대로 발달할 수 없습니다14,15,16. 시험관 내 신장 오가노이드에는 일부 EC가 포함되어 있지만, 이들은 적절한 혈관 네트워크를 형성하지 못하고 시간이 지남에 따라 감소합니다17. 따라서 오가노이드가 미성숙한 상태로 남아 있는 것은 놀라운 일이 아닙니다. 마우스에서의 이식은 신장 오가노이드 18,19,20,21의 혈관화 및 성숙을 유도한다. 안타깝게도 이것은 많은 수의 오가노이드 분석에 적합하지 않은 노동 집약적인 공정입니다.
닭 배아는 한 세기 이상 혈관 형성과 발달을 연구하는 데 사용되어 왔습니다22. 그들은 쉽게 접근 할 수 있고, 유지 보수가 적고, 완전한 기능을 가진 면역 체계가 부족하며, 달걀 껍질을 연 후에 정상적으로 발달 할 수 있습니다23,24,25,26. 융모막(chorioallantoic membrane, CAM)에 오가노이드를 이식하면 혈관 형성이 일어나는 것으로 나타났다27. 그러나 CAM의 이식 기간과 이식편의 성숙 수준은 CAM 형성에 의해 제한되며, 이는 배아 7 일까지 완료됩니다. 따라서 최근 닭 배아에서 뇌내이식을 통해 신장 오가노이드를 효율적으로 혈관화하고 성숙시키는 방법이 개발되었다28. 닭 배아의 백두강은 1930년대부터 배아 조직의 분화에 유리한 환경으로 알려져 왔다29,30. 배아 발달 초기에 접근할 수 있으며 이식편을 모든 방향으로 비교적 무제한으로 확장할 수 있습니다.
이 논문은 4일차 닭 배아의 celomic cavity에 hiPSC 유래 신장 오가노이드를 이식하기 위한 프로토콜을 간략하게 설명합니다. 이 방법은 8일 이내에 오가노이드의 혈관 형성 및 향상된 성숙을 유도합니다. 배아를 희생하기 전에 형광 표지된 수정체 쿨리나리스 응집소(LCA)를 주입하면 컨포칼 현미경을 통해 오가노이드 내의 관류된 혈관을 시각화할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 원고에서는 닭 배아에서 hiPSC 유래 신장 오가노이드의 뇌내 이식을 위한 프로토콜이 시연됩니다. 이식 시 오가노이드는 인간 오가노이드 유래 EC와 닭 유래 EC의 조합으로 구성된 관류 혈관에 의해 혈관화됩니다. 이들은 오가노이드 전체에 퍼져 사구체 구조를 침범하여 EC와 족세포 사이의 상호 작용을 가능하게 합니다. 이전에 이것이 오가노이드 사구체 및 관형 구조의 성숙을 향상시키는 것으?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
닭 배아 주입에 도움을 준 George Galaris(LUMC, Leiden, Netherlands)에게 감사드립니다. 우리는 Saskia van der Wal-Maas (Department of Anatomy & Embryology, LUMC, Leiden, the Netherlands), Conny van Munsteren (Department of Anatomy & Embryology, LUMC, Leiden, the Netherlands), Manon Zuurmond (LUMC, Leiden, the Netherlands), Annemarie de Graaf (LUMC, Leiden, the Netherlands)의 지원을 인정합니다. M. Koning은 ‘Nephrosearch Stichting tot steun van het wetenschappelijk onderzoek van de afdeling Nierziekten van het LUMC’에 의해 지원됩니다. 이 작업은 Leiden University Fund “Prof. Jaap de Graeff-Lingling Wiyadhanrma Fund” GWF2019-02의 일부 지원을 받았습니다. 이 작업은 RegMedXB (Regenerative Medicine Crossing Borders)와 Health Holland, Top Sector Life Sciences & Health의 파트너가 지원합니다. C.W. van den Berg와 T.J. Rabelink는 Novo Nordisk Foundation Center for Stem Cell Medicine(reNEW)의 지원을 받고, Novo Nordisk Foundation Center for Stem Cell Medicine은 Novo Nordisk Foundation 보조금(NNF21CC0073729)의 지원을 받습니다.
Materials
| 0.2 µm filter: Whatman Puradisc 30 syringe filter 0.2 µm | Whatman | 10462200 | |
| 35 mm glass bottom dishes | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C | |
| Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes | Sigma-Aldrich | A5177-5EA | Contains silicone tubes, mouth piece and connector |
| Confocal microscope: Leica White Light Laser Confocal Microscope | Leica | TCS SP8 | |
| Dissecting forceps, simple type. Titanium, curved, with fine sharp tips | Hammacher Karl | HAMMHTC091-10 | |
| Dissecting forceps, simple type. Titanium, straight, with fine sharp tips | Hammacher Karl | HAMMHTC090-11 | |
| Dissecting microscope | Wild Heerbrugg | 355110 | |
| Dissecting scissors, curved, OP-special, extra sharp/sharp | Hammacher Karl | HAMMHSB391-10 | |
| Donkey serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| Donkey-α-mouse Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-212-02 | dilution 1:500 |
| Donkey-α-sheep Alexa Fluor 647 | ThermoFisher Scientific | A-21448 | dilution 1:500 |
| Double edged stainless steel razor blades | Electron Microsopy Sciences | 72000 | |
| DPBS, calcium, magnesium (DPBS-/-) | ThermoFisher Scientific | 14040133 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium (DPBS+/+) | ThermoFisher Scientific | 14190094 | |
| Egg cartons or custom made egg holders | NA | NA | |
| Fertilized white leghorn eggs (Gallus Gallus Domesticus) | Drost Loosdrecht B.V. | NA | |
| Incubator | Elbanton BV | ET-3 combi | |
| Lotus Tetragonolobus lectin (LTL) Biotinylated | Vector Laboratories | B-1325 | dilution 1:300 |
| Micro scissors, straight, sharp/sharp, cutting length 10 mm | Hammacher Karl | HAMMHSB500-09 | |
| Microcapillaries: Thin wall glass capillaries 1.5 mm, filament | World Precision Instruments | TW150F-3 | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument Company | Model P-97 | We use the following settings: Heat 533, Pull 60, Velocity 150, Time 200 |
| Microscalpel holder: Castroviejo blade and pins holder, 12 cm, round handle, conical 10 mm jaws. | Euronexia | L-120 | |
| Mounting medium: Prolong Gold Antifade Mountant | ThermoFisher Scientific | P36930 | |
| Olivecrona dura dissector 18 cm | Reda | 41146-18 | |
| Parafilm | Heathrow Scientific | HS234526B | |
| Penicillin-streptomycin 5,000 U/mL | ThermoFisher Scientific | 15070063 | |
| Perforated spoon | Euronexia | S-20-P | |
| Petri dish 60 x 15 mm | CELLSTAR | 628160 | |
| Plastic transfer pipettes | ThermoFisher Scientific | PP89SB | |
| Purified mouse anti-human CD31 antibody | BD Biosciences | 555444 | dilution 1:100 |
| Rhodamine labeled Lens Culinaris Agglutinin (LCA) | Vector Laboratories | RL-1042 | This product has recently been discontinued. Vectorlabs does still produce Dylight 649 labeled LCA (DL-1048-1) and fluorescein labeled LCA (FL-1041-5) |
| Sheep anti-human NPHS1 antibody | R&D systems | AF4269 | dilution 1:100 |
| Sterile hypodermic needles, 19 G | BD microlance | 301500 | |
| Streptavidin Alexa Fluor 405 | ThermoFisher Scientific | S32351 | dilution 1:200 |
| Syringe 5 mL | BD Emerald | 307731 | |
| Transparent tape | Tesa | 4124 | Available at most hardware stores |
| Triton X | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Tungsten wire, 0.25 mm dia | ThermoFisher Scientific | 010404.H2 |
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