In vivo Studio in tempo reale degli effetti dei farmaci sul flusso sanguigno carotideo nel feto ovino

Il parto provoca stress al feto e c'è un notevole aumento dei livelli di catecolamine, il principale ormone dello stress ^1,2. Questo aumenta la pressione arteriosa sistemica e se questa pressione viene trasmessa ai fragili capillari cerebrali attraverso le arterie carotidi, questo può portare alla loro rottura ^3,4,5. I picchi di pressione arteriosa sistemica sono impediti di raggiungere il cervello dalla costrizione delle arterie carotidi nel feto a termine. Tuttavia, questo meccanismo non è sviluppato nel feto pretermine, e questo è responsabile della probabilità significativamente più elevata di danni cerebrali nei feti pretermine ^4,5.

Attualmente, non esiste un metodo adatto per esaminare la maturazione delle vie coinvolte nella regolazione del flusso sanguigno carotideo nei feti in via di sviluppo. Questi studi sul flusso sanguigno carotideo e sulla vasoreattività sono cruciali sia dal punto di vista scientifico di base che da quello clinico. Attualmente, per determinare le vie molecolari coinvolte nella regolazione della contrattilità arteriosa, il metodo standard prevede l'isolamento dei segmenti arteriosi post mortem. Successivamente, gli esperimenti vengono condotti utilizzando la miografia a filo per determinare la vasocontrattilità di diverse molecole farmacologiche che definiscono le vie regolatorie coinvolte nella contrattilità arteriosa ^6,7. Da notare che i risultati ex vivo non sono in grado di replicare completamente l'ambiente in vivo a causa della regolazione del flusso sanguigno a monte e a valle dell'arteria carotide. Pertanto, il presente studio mirava a sviluppare una tecnica in grado di determinare gli effetti di sostanze chimiche o agenti vasoresponsivi sul flusso sanguigno in un'arteria in vivo.

La metodologia di somministrazione perivascolare descritta in questo articolo fornisce un approccio in vivo per studiare l'effetto della manipolazione farmacologica o genetica delle vie di segnalazione su diversi segmenti arteriosi. Usando questo metodo, è possibile manipolare la pressione sanguigna fetale e il flusso sanguigno carotideo. Inoltre, sono stati dimostrati esperimenti con feti di pecora per studiare gli effetti delle molecole di segnalazione in un feto in via di sviluppo. Si spera che la metodologia dettagliata fornita porti a nuove indagini nel campo degli studi sul flusso sanguigno, in particolare in relazione alla fisiologia e alla patologia fetale.

Per il presente studio, l'approvazione per gli esperimenti sugli animali è stata ottenuta dal Comitato per la cura e l'uso degli animali dell'Università dell'Arizona. Per il presente studio sono state utilizzate pecore Columbia-Rambouillet gravide accoppiate nel tempo di età compresa tra i 2 e i 4 anni. Gli animali sono stati ottenuti dall'Unità Pecore dell'Università dell'Arizona.

1. Mantenimento degli animali

1. Procurati animali da qualsiasi allevamento di pecore.
2. Trasportare le pecore in laboratorio a 105 giorni ± 5 giorni a 137 giorni ± 5 giorni di età gestazionale (dGA). Mantenere le pecore a una temperatura di 22 °C ± 1 °C in condizioni di umidità ambientale. Fornire pellet di erba medica (vedi Tabella dei materiali), sali e acqua ad libitum.

2. Preparazione del materiale

1. Costruire il sistema di cateteri perivascolari.
   1. Unire un'estremità di 4 piedi di tubo Tygon a un tubo della pompa del collettore da 2 cm (MPT) (vedere la tabella dei materiali). Collegare l'altra estremità dell'MPT da 2 cm a un altro tubo Tygon da 4 piedi.
   2. Fai una piccola fessura nell'MPT in modo che il liquido/agenti possano uscire nello spazio perivascolare.
2. Sterilizzare le sonde di flusso (vedere la tabella dei materiali), i cateteri e un piccolo cacciavite utilizzando il metodo di sterilizzazione a gas.

3. Preparazione prechirurgica dell'animale

1. Ottenere l'approvazione per gli esperimenti sugli animali dal Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali.
2. Prima dell'intervento chirurgico, tenere le pecore alimentate con mangime a zero per os (NPO) per 24 ore e acqua NPO per 16 ore. Il giorno dell'intervento, avvolgi il muso della pecora con un tampone per proteggere i suoi occhi. Radere il lato sinistro del collo per esporre la vena giugulare e pulire la pelle con iodio povidone ed etanolo al 70%.
   1. Posizionare un catetere endovenoso (IV) nella vena giugulare della pecora e fissarlo alla pelle con nastro impermeabile e clip per ferite (vedere Tabella dei materiali).
3. Anestetizzare le pecore con una somministrazione endovenosa di diazepam (0,15 mg/kg) e ketamina cloridrato (16 mg/kg). Somministrare un'iniezione IM di penicillina G sospensione di procaina (25.000 I/kg) e ketoprofene EV (2,2 mg/kg) (vedere Tabella dei materiali).
4. Radere il sito di incisione della pecora e le aree circostanti (addome, fianchi e inguine) con un tagliacoltelli a lama #10. Per assicurarti che la lana sia completamente rimossa, radere nuovamente l'area con una lama #40. Lavare l'area rasata con un detergente germicida (vedi Tabella dei materiali) e acqua. Asciugare con un tampone monouso.
5. Confermare la profondità dell'anestesia (determinata e mantenuta dalla risposta al pizzicamento cutaneo, al riflesso corneale e alla valutazione del tono della mandibola), quindi intubare la pecora con un tubo endotracheale di diametro interno di 6,5-7,5 mm (vedere la tabella dei materiali) e fissare il tubo in posizione. Posizionare la pecora su un tavolo elevatore in posizione sdraiata laterale e trasferirla su un tavolo chirurgico V-top in posizione supina.
   1. Fissare gli arti della pecora al tavolo chirurgico V-top con legature chirurgiche. Portare la pecora in posizione di Trendelenburg per alleviare la pressione sull'unità feto-placentare.
6. Collegare una sonda per pulsossimetro (vedere la tabella dei materiali) alla lingua/orecchio della pecora per monitorare continuamente la saturazione dell'ossiemoglobina e la frequenza cardiaca. Metti un termometro sotto la lingua della pecora per monitorare la temperatura.
   1. Collegare il tubo endotracheale al circuito respiratorio della macchina per anestesia e avviare la ventilazione meccanica monitorando la CO₂ espirata.
7. Mantenere l'anestesia regolando l'isoflurano tra il 2,5% e il 4% durante l'intervento. Assicurarsi che l'animale sia adeguatamente anestetizzato pizzicando l'orecchio. Somministrare una soluzione poliionica bilanciata (soluzione salina 0,9% p/v) a 5 ml/kg/h utilizzando il catetere giugulare posizionato durante la fase 3.2.1.
8. Eseguire uno scrub sterile. Spruzzare la zona addominale e i fianchi con una soluzione di povidone (soluzione di iodio al 10%). Strofinare l'area con una garza imbevuta di iodio partendo dal sito dell'incisione e procedendo verso l'esterno, facendo attenzione a non tornare al centro dopo aver strofinato verso l'esterno.
   1. Successivamente, spruzzare l'area con etanolo (etanolo al 70% p/v) e strofinare con una garza imbevuta di etanolo in modo simile allo scrub con povidone. Ripeti l'intero processo tre volte. Spruzzare l'area con una soluzione di povidone.
9. Scaldare la soluzione fisiologica in un contenitore sterile e portarla a 37 °C. Tienilo vicino al tavolo operatorio. Collegare il cauterizzazione (vedi Tabella dei materiali).
10. Chiedi ai membri dell'équipe chirurgica di vestirsi con berretti, maschere per il viso e copriscarpe, lavarsi le mani (scrub chirurgico) e indossare camici e guanti chirurgici sterilizzati. Da questo momento in poi, è necessario seguire una rigorosa pratica chirurgica sterile.
11. Copri la zona addominale della pecora sterilizzata con asciugamani sterili.

4. Procedura chirurgica

1. Esteriorizzare il feto
   1. Dopo aver assicurato un'adeguata profondità di anestesia, eseguire un'incisione laparotomica standard di 10 cm utilizzando un bisturi (lama #20) sulla linea alba dall'ombelico alla porzione cranica della mammella. Controllare l'emorragia mentre si esegue un'incisione con un cauterizzatore (impostazioni di potenza: 50 taglio e 25 coagulazione).
      1. Praticare una piccola incisione attraverso la linea mediana della parete del corpo sotto l'incisione cutanea e aprire la cavità addominale utilizzando le forbici Metzenbaum (vedi Tabella dei materiali).
   2. Esternalizzare l'utero contenente il feto attraverso la parete addominale posizionando asciugamani chirurgici sterili al di sotto (tra l'addome materno e l'utero). Palpare l'utero per determinare la posizione fetale e i cotiledoni. Usando un cauterizzatore, praticare un'incisione di ~10 cm attraverso la parete uterina con un'ampia curvatura sopra il dorso della testa, evitando vasi sanguigni e placentomi visibili.
   3. Utilizzare quattro pinze di Babcock (vedere la tabella dei materiali) per fissare l'utero e le membrane placentari e tirare le pinze di Babcock ai quattro angoli opposti per rendere visibile la testa del feto. Esternalizzare la metà cranica del feto attraverso questa incisione e coprire la testa del feto con un guanto sterile, non in lattice, riempito con soluzione salina calda e sterile (37 °C) per impedire l'inizio della respirazione.
2. Strumentazione del catetere perivascolare dell'arteria carotide
   1. Quando si rimuove la testa fetale dall'utero, chiedere a un assistente di tenere delicatamente la pinza Babcock in posizione verticale per ridurre al minimo la perdita di liquido amniotico. Con il collo del feto esposto, eseguire un'incisione cutanea obliqua di 3-3,5 cm lungo il bordo anteriore del muscolo sternocleidomastoideo (SCM) su un lato del collo nella regione centrale e separare la fascia con una pinza per zanzare.
      1. Dividere il platisma ed eseguire una dissezione lungo il bordo mediale del muscolo SCM dal suo tendine superiormente al livello del muscolo omoioideo inferiormente. La retrazione dell'SCM esporrà il foglio carotideo, che contiene superficialmente una vena giugulare interna a parete sottile, e sotto di esso ci sarà l'arteria carotide come un vaso a parete spessa.
      2. Ritrarre la pelle con le pinze di Babcock ed eseguire una dissezione smussata per liberare l'arteria carotide dal tessuto circostante e dal foglio carotideo.
   2. Estrarre la sonda di flusso da 3 mm (vedere la tabella dei materiali) dalla confezione sterile, svitare la piastra di supporto della sonda e aprirla per esporre la staffa a L. Sollevare con cautela l'arteria carotide e agganciare delicatamente la staffa sotto il vaso evitando il contatto con il vaso.
      1. Utilizzare una pinza per chiudere la staffa della sonda di flusso facendo scorrere delicatamente la piastra di supporto in posizione chiusa. Fissare la staffa della sonda di flusso serrando la vite di supporto della sonda di flusso. Per facilitare questo processo, afferrare delicatamente le estremità della sonda di flusso con una pinza per stabilizzare la sonda di flusso mentre la vite viene serrata.
   3. Prelavare il catetere perivascolare e posizionarlo nelle immediate vicinanze dell'arteria carotide prossimale alla sonda di flusso. Assicurarsi che la fessura aperta del catetere perivascolare si trovi in prossimità dell'arteria carotide.
      1. Con una sutura non assorbibile in seta 3-0, fissare le estremità prossimali e distali del sistema perivascolare e la sonda di flusso al tessuto interstiziale vicino. Chiudere il sito di incisione con un punto continuo, chiudere la pelle fetale con una sutura non assorbibile in seta 3-0 e fissare i cateteri alla pelle avvolgendo la sutura attorno al catetere tre volte. Rimuovere il guanto e riposizionare la testa fetale nell'utero.
3. Cateterismo fetale degli arti
   1. Esteriorizzare la zampa posteriore del feto. Tieni la gamba e girala lateralmente per visualizzare l'area interna della coscia. Pulire l'area con una garza sterile, eseguire un'incisione di 2 cm ed esporre l'arteria femorale. Posizionare e fissare la sonda di flusso seguendo una procedura simile a quella eseguita con la carotide, quindi chiudere l'incisione.
   2. Praticare un'incisione di 2 cm lungo l'aspetto mediale della tibia ~0,5 cm distale rispetto al ginocchio. Esporre l'arteria tibiale posteriore (a parete spessa) e la vena safena (a parete sottile). Inserire cateteri in polivinile (diametro esterno: 1,4 mm e diametro interno: 0,9 mm) nell'arteria tibiale posteriore e nella vena safena utilizzando una tecnica di cut-down standard, come indicato di seguito:
      1. Libera il vaso di interesse con una dissezione contundente. Legare la porzione distale del vaso con una sutura di seta 3-0 (senza ago) utilizzando un nodo quadrato con tre lanci. Pre-posizionare una seconda fascetta senza seta sulla faccia prossimale del vaso (sotto il vaso), ma lasciare la legatura slacciata. Usando le forbici Castroviejo (vedi Tabella dei materiali), praticare un piccolo taglio trasversale nel vaso 2 mm prossimale alla legatura distale. La lunghezza del taglio dovrebbe essere ~25% del diametro del recipiente.
      2. Limitare il flusso sanguigno dei vasi tirando delicatamente verso l'alto la sutura prossimale e slegata. Riempire il catetere con soluzione fisiologica eparinizzata sterile. Inserire l'estremità smussata del catetere e far avanzare la punta di 20 cm nel vaso fetale.
      3. Tenere il catetere in posizione con una pinza mentre un assistente lega la sutura prossimale in seta libera per fissare il vaso al catetere; Legare completamente il vaso attorno al catetere inserito utilizzando nodi quadrati a 2 mm dal sito di inserimento con tre lanci. Legare la legatura distale prossimale alla legatura prossimale che fissa il vaso al catetere.
   3. Chiudere l'incisione cutanea utilizzando una sutura non assorbibile in seta 3-0 utilizzando uno schema di sutura continuo. Assicurarsi che i punti di sutura siano legati attorno ai cateteri per evitare di limitare il flusso sanguigno se tirati. Posizionare un catetere pre-lavato nell'utero e fissarlo al feto con una sutura utilizzando una sutura di seta non assorbibile 3-0.

5. Riposizionare il feto all'indietro e chiudere la ferita

1. Riportare il feto nell'utero. Suturare le membrane fetali utilizzando suture di seta non assorbibili 3-0 con un modello di bloccaggio continuo (Cushing). Chiudere lo strato muscolare uterino utilizzando una sutura di seta non assorbibile 3-0.
2. Inserire un'asta chirurgica in acciaio inossidabile da 18 pollici per via sottocutanea lungo la parete addominale fino alla regione paracostale. Lasciare che l'estremità prossimale dell'asta esca dal sito paracostale eseguendo un'incisione di 1 cm.
   1. Collegare i cateteri all'estremità distale dell'asta chirurgica e chiedere a un assistente di far passare i cateteri e il cavo della sonda di flusso attraverso il sito di uscita paracostale spingendo completamente l'asta attraverso l'apertura paracostale.
3. Fissare tutti i cateteri e i cavi della sonda di flusso nel sito di incisione paracostale. Posizionare con nastro adesivo impermeabile e suturare i cateteri sulla pelle della pecora. Suturare una sacca di plastica a rete all'esterno della pecora sopra i cateteri e sondare per conservare i cateteri.
   1. Utilizzando un materiale di sutura sintetico assorbibile monofilamento 1-0, fissare la linea alba con un motivo continuo. Fissare lo strato cutaneo con graffette chirurgiche.
4. Interrompere l'anestesia generale ed estubare la pecora una volta che i riflessi laringei sono tornati alla normale linea di base. Non lasciare l'animale incustodito fino a quando non ha ripreso completamente conoscenza. Spostare la pecora nel carrello metabolico una volta che si è stabilizzata dopo l'anestesia generale. Riportare l'animale nella sala esperimenti post-operatoria dopo essersi completamente ripreso dall'anestesia.
5. Somministrare analgesici post-operatori per via endovenosa (10 mg/kg/die fenilbutazone) per 3 giorni. Sciacquare quotidianamente i cateteri vascolari con soluzione salina eparinizzata (100 U/mL di eparina in soluzione di NaCl allo 0,9%).

6. Esperimenti post-operatori in vivo

1. Lavare i cateteri ogni giorno con soluzione fisiologica eparinizzata (75 U/ml). Attendere 72 ore prima di effettuare qualsiasi misurazione. Per misurare il flusso sanguigno, collegare le sonde di flusso inserite nel feto con il modulo di flusso perivascolare a PowerLab e a un computer collegato.
   NOTA: Le registrazioni possono essere effettuate sul software PowerLab (vedere la tabella dei materiali) per misurare il flusso sanguigno carotideo e femorale. Effettuare la misurazione di base per 30 minuti.
2. Collegare i cateteri arteriosi e amniotici all'amplificatore a ponte collegato a un convertitore analogico-digitale (vedere Tabella dei materiali). Somministrare un bolo da 1 mL di fenilefrina da 10 uM al feto per via endovenosa e misurare il flusso carotideo e femorale per 15 minuti. Quindi, attendere 30 minuti o fino a quando il flusso sanguigno non torna al basale.
3. Infondere 1 mL di fenilefrina 10 uM nel catetere perivascolare e misurare il flusso sanguigno per 15 minuti. Lavare via la fenilefrina somministrando 5 ml di soluzione fisiologica calda attraverso il catetere perivascolare. Quindi, attendere 30 minuti o fino a quando il flusso sanguigno non torna al basale.

Per esaminare la manipolazione localizzata in vivo del flusso sanguigno, 1 mL di fenilefrina (10 μM), un agonista α_1-AR, è stato somministrato nello spazio perivascolare dell'arteria carotide mediante un catetere per infusione esteriorizzato per determinare l'effetto sul flusso sanguigno carotideo locale e l'effetto sulla pressione sanguigna sistemica. La Figura 1A mostra una significativa riduzione del flusso sanguigno carotideo senza alcun effetto sulla pressione arteriosa sistemica nelle pecore fetali a breve termine. La Figura 1B mostra gli stessi dati per un feto pretermine. La somministrazione di 1 mL di PHE per via endovenosa ha aumentato il flusso sanguigno sistemico senza influenzare il flusso sanguigno carotideo nelle pecore fetali a breve termine (Figura 1C). La Figura 1D mostra gli stessi dati per un feto pretermine. Al contrario, la somministrazione di PHE mediante un catetere perivascolare non ha avuto alcun effetto nelle pecore pretermine; tuttavia, la somministrazione per via endovenosa ha causato un aumento significativo sia del flusso sanguigno carotideo che della pressione arteriosa sistemica. Questo esperimento dimostra un manicotto perivascolare completamente funzionale in grado di regolare il flusso sanguigno nell'arteria carotide in utero senza influenzare la pressione arteriosa sistemica. I risultati mostrano che i feti pretermine non rispondono alla regolazione del flusso sanguigno carotideo mediata dalla fenilefrina; tuttavia, la risposta è matura nei feti a breve termine (Figura 1E). È importante sottolineare che la somministrazione endovenosa di PHE ha aumentato il flusso sanguigno carotideo solo nei feti pretermine, senza alcun effetto significativo nei feti a breve termine (Figura 1G). Tuttavia, la somministrazione endovenosa di PHE ha aumentato la pressione arteriosa sistemica sia nei feti pretermine che in quelli a breve termine (Figura 1H). I risultati dimostrano anche che l'instillazione perivascolare di fenilefrina non ha avuto alcun effetto sulla pressione arteriosa sistemica (Figura 1F).

Figura 1: Manipolazione in vivo del flusso sanguigno. Una traccia esemplare di misurazione e cambiamenti basali della pressione arteriosa sistemica e del flusso sanguigno dell'arteria carotide a seguito della somministrazione di fenilefrina (PHE) attraverso il catetere perivascolare da (A) un feto a breve termine in utero e (B) un feto pretermine in utero . Una traccia esemplare della pressione sanguigna sistemica e del flusso sanguigno dell'arteria carotide, misurazioni basali e cambiamenti a seguito della somministrazione endovenosa di fenilefrina (PHE) da (C) un feto a breve termine in utero e (D) un feto pretermine in utero . Vengono mostrate le variazioni della percentuale (E) del flusso sanguigno carotideo e (F) della pressione arteriosa sistemica attraverso il sistema di somministrazione del catetere perivascolare per le pecore a breve termine e pretermine. Vengono mostrati i cambiamenti nella percentuale (G) del flusso sanguigno carotideo e nella pressione sanguigna sistemica (H) attraverso la somministrazione sistemica per le pecore a breve termine e pretermine. Le barre di errore mostrano l'errore standard della media. N = 4 in ogni gruppo. *P < 0,05 da un test t di Student. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Attualmente, non esiste alcun metodo per esaminare la contrattilità e la dilatazione dei vasi in vivo in risposta a composti farmacologici e manipolazione genica. Come standard nel campo, il flusso sanguigno in vivo viene misurato da sonde di flusso Doppler, microsfere e molecole radioattive come l'acqua triziata. Tuttavia, per manipolare le funzioni dei recettori o la segnalazione a valle, gli animali vengono sacrificati e vengono condotti esperimenti in vitro in bagni d'organo dopo l'isolamento di segmenti arteriosi. I metodi attuali forniscono un modo per condurre manipolazioni in vivo di segmenti arteriosi introducendo sostanze chimiche o vettori per modificare l'espressione genica. Inoltre, questo metodo ha un effetto minimo sulla circolazione sistemica a causa della somministrazione locale degli agenti.

Gli esperimenti attuali dimostrano che la somministrazione di fenilefrina provoca la costrizione dell'arteria carotide con una riduzione del flusso sanguigno. L'indagine di cui sopra chiarisce il ruolo dei recettori alfa-adrenergici nella regolazione del flusso sanguigno dell'arteria carotide al cervello. Questa tecnica può essere utilizzata per esaminare l'effetto di diversi composti farmacologici sul flusso sanguigno in tempo reale nei feti vivi. Il catetere perivascolare può anche essere utilizzato per instillare lentivirus nello spazio perivascolare, che viene assorbito dal sistema vascolare, per provocare il knockdown o la sovraespressione della proteina di segnalazione o del recettore desiderato.

Per decenni, i bagni di organi e tessuti hanno fornito dati utili per quanto riguarda la contrattilità dei vasi ^6,8,9. Tuttavia, questi studi sono ex vivo, il che solleva interrogativi sulla riproducibilità in vivo e significa che non è possibile eseguire misurazioni continue. Per superare questa limitazione, questo approccio innovativo esamina il flusso sanguigno dell'arteria carotide in vivo. Un ulteriore progresso in questa metodologia includerà l'adozione della modulazione genetica utilizzando approcci di somministrazione del virus, che consentiranno di modificare geneticamente i segmenti arteriosi per sovraregolare e sottoregolare l'espressione genica somministrando shRNA o CRISPR/Cas9.

La fase critica del protocollo consiste nel posizionare il catetere perivascolare parallelamente al vaso nelle immediate vicinanze. Affinché questo funzioni, è necessario conoscere il diametro dell'arteria bersaglio. Inoltre, è importante sviluppare una manica adeguata. Si può posizionare il manicotto adiacente all'arteria da modulare invece di circondarla. Ciò consentirà anche la consegna locale delle sostanze chimiche e degli agenti mirati.

Il limite del metodo è che regola solo un segmento dell'arteria e i risultati relativi al flusso sanguigno di organi o tessuti devono essere interpretati con attenzione. Potrebbe essere necessario modificare la lunghezza del manicotto e la quantità di sostanze chimiche per ottenere l'effetto desiderato. Il metodo ha ampie applicazioni nella modulazione della regolazione genica nei feti vivi. Questo può essere adattato per modulare la funzione e l'espressione genica in una porzione di qualsiasi tessuto. Inoltre, il metodo può essere applicato per modulare l'espressione genica in un organismo adulto.

Sebbene esistano altri metodi per misurare il flusso sanguigno in vivo , come l'utilizzo di sonde di flusso transonico¹⁰, laser Doppler¹¹ e microsfere¹², nessuno di questi metodi consente di esaminare l'effetto locale dei farmaci sul flusso sanguigno nel segmento arterioso rispetto agli effetti sistemici dell'intervento. Pertanto, il metodo attuale è unico, in quanto può misurare e modulare il flusso sanguigno locale senza effetti sistemici.