In vivo Étude en temps réel des effets des médicaments sur le flux sanguin carotidien chez le fœtus ovin

La naissance provoque du stress pour le fœtus et il y a une augmentation considérable des niveaux de catécholamines, la principale hormone du stress ^1,2. Cela augmente la pression artérielle systémique, et si cette pression est transmise aux capillaires cérébraux fragiles via les artères carotides, cela peut entraîner leur rupture ^3,4,5. Les poussées de pression artérielle systémique sont empêchées d’atteindre le cerveau par la constriction des artères carotides chez le fœtus à terme. Cependant, ce mécanisme n’est pas développé chez le fœtus prématuré, ce qui est responsable de la probabilité significativement plus élevée de lésions cérébrales chez les fœtus prématurés ^4,5.

Actuellement, il n’existe aucune méthode appropriée pour examiner la maturation des voies impliquées dans la régulation du flux sanguin carotidien chez les fœtus en développement. Ces études sur le débit sanguin carotidien et la vasoréactivité sont cruciales à la fois d’un point de vue scientifique et clinique. Actuellement, pour déterminer les voies moléculaires impliquées dans la régulation de la contractilité artérielle, la méthode standard consiste à isoler les segments artériels post-mortem. Ensuite, les expériences sont menées à l’aide de la myographie filaire pour déterminer la vasocontractilité de différentes molécules pharmacologiques qui définissent les voies régulatrices impliquées dans la contractilité artérielle ^6,7. Il convient de noter que les résultats ex vivo ne sont pas en mesure de reproduire complètement l’environnement in vivo en raison de la régulation du flux sanguin en amont et en aval de l’artère carotide. Ainsi, la présente étude visait à développer une technique permettant de déterminer les effets de produits chimiques ou d’agents vasosensibles sur le flux sanguin dans une artère in vivo.

La méthodologie d’administration périvasculaire décrite dans cet article fournit une approche in vivo pour étudier l’effet de la manipulation pharmacologique ou génétique des voies de signalisation sur différents segments artériels. En utilisant cette méthode, on peut manipuler la pression artérielle fœtale et le flux sanguin carotidien. De plus, des expériences sur des fœtus de mouton sont démontrées pour étudier les effets des molécules de signalisation chez un fœtus en développement. Espérons que la méthodologie détaillée fournie conduira à de nouvelles recherches dans le domaine des études sur le flux sanguin, en particulier en ce qui concerne la physiologie et la pathologie fœtales.

Pour la présente étude, l’approbation des expériences sur les animaux a été obtenue auprès du Comité de protection et d’utilisation des animaux de l’Université de l’Arizona. Une brebis Columbia-Rambouillet gestante accouplée dans le temps entre 2 et 4 ans a été utilisée pour la présente étude. Les animaux ont été obtenus auprès de l’unité ovine de l’Université de l’Arizona.

1. Entretien des animaux

1. Obtenez des animaux de n’importe quel ranch de moutons.
2. Transporter les brebis au laboratoire à 105 jours ± 5 jours à 137 jours ± 5 jours d’âge gestationnel (dGA). Maintenez les moutons à une température de 22 °C ± 1 °C dans l’humidité ambiante. Fournir des granulés de luzerne (voir le tableau des matières), des sels et de l’eau à volonté.

2. Préparation du matériel

1. Construire le système de cathéter périvasculaire.
   1. Joignez une extrémité de 4 pieds de tube Tygon à un tube de pompe collecteur de 2 cm (MPT) (voir le tableau des matériaux). Fixez l’autre extrémité du MPT de 2 cm à un autre tube Tygon de 4 pieds.
   2. Faites une petite fente dans le MPT pour que le liquide/les agents puissent sortir dans l’espace périvasculaire.
2. Stérilisez les sondes de débit (voir le tableau des matériaux), les cathéters et un petit tournevis en utilisant la méthode de stérilisation au gaz.

3. Préparation préchirurgicale de l’animal

1. Obtenir l’approbation pour les expériences sur les animaux du Comité institutionnel de protection et d’utilisation des animaux.
2. Avant la chirurgie, gardez les brebis avec de la nourriture sans alcool pendant 24 h et de l’eau pendant 16 h. Le jour de l’opération, enveloppez le visage de la brebis avec un coussinet pour protéger ses yeux. Rasez le côté gauche du cou pour exposer la veine jugulaire et nettoyez la peau avec de la povidone iodée et de l’éthanol à 70 %.
   1. Placez un cathéter intraveineux (IV) dans la veine jugulaire de la brebis et fixez-le à la peau avec du ruban adhésif imperméable et des pinces à plaie (voir le tableau des matériaux).
3. Anesthésier les brebis avec une administration IV de diazépam (0,15 mg/kg) et de chlorhydrate de kétamine (16 mg/kg). Administrer une injection IM de pénicilline G en suspension de procaïne (25 000 I/kg) et de cétoprofène IV (2,2 mg/kg) (voir le tableau des matières).
4. Rasez le site d’incision du mouton et les zones environnantes (abdomen, flancs et aine) avec un coupe-lame #10. Pour vous assurer que la laine est complètement enlevée, rasez à nouveau la zone avec une lame #40. Lavez la zone rasée avec un nettoyant germicide (voir tableau des matériaux) et de l’eau. Séchez avec une serviette jetable.
5. Confirmer la profondeur de l’anesthésie (déterminée et maintenue par la réponse au pincement cutané, au réflexe cornéen et à l’évaluation du tonus de la mâchoire), puis intuber la brebis avec une sonde endotrachéale de 6,5 à 7,5 mm de diamètre interne (voir le tableau des matériaux) et fixer la sonde en place. Placez la brebis sur une table élévatrice en position couchée latérale et transférez-la sur une table chirurgicale en V en position couchée.
   1. Fixez les membres de la brebis à la table chirurgicale en V avec des attaches chirurgicales. Amenez la brebis en position de Trendelenburg pour alléger la pression sur l’unité fœto-placentaire.
6. Fixez une sonde d’oxymètre de pouls (voir le tableau des matériaux) à la langue ou à l’oreille de la brebis pour surveiller en permanence la saturation en oxyhémoglobine et la fréquence cardiaque. Placez un thermomètre sous la langue de la brebis pour surveiller la température.
   1. Connectez le tube endotrachéal au circuit respiratoire de l’appareil d’anesthésie et lancez la ventilation mécanique tout en surveillant le CO₂ expiré.
7. Maintenez l’anesthésie en ajustant l’isoflurane entre 2,5 % et 4 % tout au long de la chirurgie. Assurez-vous que l’animal est correctement anesthésié en pinçant l’oreille. Administrer une solution polyionique équilibrée (solution saline à 0,9 % p/v) à 5 mL/kg/h à l’aide du cathéter jugulaire placé à l’étape 3.2.1.
8. Effectuez un gommage stérile. Vaporiser la zone abdominale et les flancs avec une solution de povidone (solution d’iode à 10 %). Frottez la zone avec une gaze imbibée d’iode en partant du site d’incision et en allant vers l’extérieur, en veillant à ne pas revenir au centre après avoir frotté vers l’extérieur.
   1. Ensuite, vaporisez la zone avec de l’éthanol (70% d’éthanol p/v) et frottez avec une gaze imbibée d’éthanol de la même manière que le gommage avec de la povidone. Répétez tout le processus trois fois. Vaporisez la zone avec une solution de povidone.
9. Réchauffez une solution saline dans un récipient stérile et portez-la à 37 °C. Gardez-le près de la table d’opération. Connectez la cautérisation (voir tableau des matériaux).
10. Demandez aux membres de l’équipe chirurgicale de porter des casquettes, des masques faciaux et des couvre-chaussures, de se laver les mains (gommage chirurgical) et de mettre des blouses et des gants chirurgicaux stérilisés. À partir de ce moment, une pratique chirurgicale stérile stricte doit être suivie.
11. Drapez la zone abdominale du mouton stérilisé avec des serviettes stériles.

4. Intervention chirurgicale

1. Extériorisation du fœtus
   1. Après s’être assuré d’une profondeur d’anesthésie adéquate, effectuer une incision de laparotomie standard de 10 cm à l’aide d’un scalpel (lame #20) sur la linea alba de l’ombilic à la partie crânienne du pis. Contrôlez le saignement tout en pratiquant une incision avec un cautère (réglages de puissance : 50 coupures et 25 coagulations).
      1. Faites une petite incision à travers la ligne médiane de la paroi corporelle sous l’incision cutanée et ouvrez la cavité abdominale à l’aide de ciseaux Metzenbaum (voir Tableau des matériaux).
   2. Extérioriser l’utérus contenant le fœtus à travers la paroi abdominale tout en plaçant des serviettes chirurgicales stériles en dessous (entre l’abdomen maternel et l’utérus). Palper l’utérus pour déterminer la position fœtale et les cotylédons. À l’aide d’un cautérisme, faites une incision de ~10 cm à travers la paroi utérine avec une grande courbure sur le dos de la tête, en évitant les vaisseaux sanguins et les placentomies visibles.
   3. Utilisez quatre pinces de Babcock (voir le tableau des matériaux) pour fixer l’utérus et les membranes placentaires, et tirez les pinces de Babcock aux quatre coins opposés pour rendre la tête du fœtus visible. Extérioriser la moitié crânienne du fœtus par cette incision et couvrir la tête du fœtus avec un gant stérile sans latex rempli d’une solution saline chaude et stérile (37 °C) pour empêcher l’initiation de la respiration.
2. Instrumentation du cathéter périvasculaire de l’artère carotide
   1. Lorsque vous retirez la tête fœtale de l’utérus, demandez à un assistant de tenir doucement la pince de Babcock à la verticale pour minimiser la perte de liquide amniotique. Avec le cou du fœtus exposé, effectuez une incision cutanée oblique de 3 à 3,5 cm le long du bord antérieur du muscle sterno-cléido-mastoïdien (SCM) d’un côté du cou dans la région médiane, et séparez le fascia avec une pince anti-moustiques.
      1. Divisez le platysma et effectuez une dissection le long du bord médial du muscle SCM de son tendon vers le haut jusqu’au niveau du muscle omohyoïdien vers le bas. La rétraction de la SCM exposera la feuille carotidienne, qui contient superficiellement une veine jugulaire interne à paroi mince, et en dessous se trouvera l’artère carotide sous forme de vaisseau à paroi épaisse.
      2. Rétractez la peau avec des pinces de Babcock et effectuez une dissection contondante pour libérer l’artère carotide du tissu environnant et de la feuille carotidienne.
   2. Prenez la sonde de débit de 3 mm (voir tableau des matériaux) de l’emballage stérile, dévissez la plaque de support de la sonde et faites-la glisser pour exposer le support en L. Soulevez délicatement l’artère carotide et accrochez doucement le support sous le vaisseau tout en évitant tout contact avec le vaisseau.
      1. Utilisez une pince pour fermer le support de la sonde de débit en faisant glisser doucement la plaque de support en position fermée. Fixez le support de la sonde de débit en serrant la vis de support de la sonde de débit. Pour faciliter ce processus, saisissez doucement les extrémités de la sonde de débit avec une pince pour stabiliser la sonde de débit pendant que la vis est serrée.
   3. Pré-rincez le cathéter périvasculaire et placez-le à proximité de l’artère carotide à proximité de la sonde d’écoulement. Assurez-vous que la fente ouverte du cathéter périvasculaire est à proximité de l’artère carotide.
      1. Avec une suture non résorbable en soie 3-0, fixez les extrémités proximales et distales du système périvasculaire et la sonde d’écoulement au tissu interstitiel voisin. Fermez le site d’incision à l’aide d’un point de suture continu, fermez la peau du fœtus avec une suture non résorbable en soie 3-0 et fixez les cathéters à la peau en enroulant la suture autour du cathéter trois fois. Retirez le gant et replacez la tête du fœtus dans l’utérus.
3. Cathétérisme des membres du fœtus
   1. Extérioriser la patte arrière du fœtus. Tenez la jambe et tournez-la sur le côté pour visualiser la zone intérieure de la cuisse. Nettoyez la zone avec de la gaze stérile, effectuez une incision de 2 cm et exposez l’artère fémorale. Placez et fixez la sonde de débit en suivant une procédure similaire à celle de la carotide, puis fermez l’incision.
   2. Faites une incision de 2 cm le long de la face médiale du tibia ~0,5 cm distal au genou. Exposer l’artère tibiale postérieure (paroi épaisse) et la veine saphène (paroi mince). Insérez des cathéters en polyvinyle (diamètre extérieur : 1,4 mm et diamètre intérieur : 0,9 mm) dans l’artère tibiale postérieure et la veine saphène en utilisant une technique de coupe standard, comme mentionné ci-dessous :
      1. Libérez le vaisseau d’intérêt avec une dissection contondante. Lister la partie distale du vaisseau avec une suture en soie 3-0 (sans aiguille) en utilisant un nœud carré avec trois lancers. Pré-placez une deuxième attache sans soie à la face proximale du vaisseau (sous le vaisseau), mais laissez la ligature non nouée. À l’aide de ciseaux Castroviejo (voir Tableau des matériaux), faites une petite incision transversale dans le vaisseau à 2 mm à proximité de la ligature distale. La longueur de la coupe doit être de ~25% du diamètre du récipient.
      2. Limitez le flux sanguin des vaisseaux en tirant doucement sur la suture proximale non nouée. Remplissez le cathéter avec une solution saline héparinée stérile. Insérez l’extrémité biseautée du cathéter et avancez l’extrémité de 20 cm dans le vaisseau fœtal.
      3. Maintenez le cathéter en place avec une pince pendant qu’un assistant attache la suture proximale en soie pour fixer le vaisseau au cathéter ; ligaturer complètement le vaisseau autour du cathéter inséré à l’aide de nœuds carrés à 2 mm du site d’insertion avec trois lancers. Attachez la ligature distale proximale à l’attache proximale fixant le vaisseau au cathéter.
   3. Fermez l’incision cutanée à l’aide d’une suture en soie non résorbable 3-0 utilisant un motif de suture continue. Assurez-vous que les sutures sont attachées autour des cathéters pour éviter de restreindre le flux sanguin si vous les tirez. Placez un cathéter pré-rincé dans l’utérus et fixez-le au fœtus par une suture à l’aide d’une suture en soie non résorbable 3-0.

5. Remettre le fœtus en place et refermer la plaie

1. Remettre le fœtus dans l’utérus. Suturez les membranes fœtales à l’aide de sutures en soie non résorbables 3-0 avec un motif de verrouillage continu (Cushing). Fermez la couche musculaire utérine à l’aide d’une suture en soie non résorbable 3-0.
2. Insérez une tige chirurgicale en acier inoxydable de 18 pouces par voie sous-cutanée le long de la paroi abdominale jusqu’à la région paracostale. Laissez l’extrémité proximale de la tige sortir du site paracostal en effectuant une incision de 1 cm.
   1. Fixez les cathéters à l’extrémité distale de la tige chirurgicale et demandez à un assistant de faire passer les cathéters et le câble de la sonde à travers le site de sortie paracostale en poussant complètement la tige à travers l’ouverture paracostale.
3. Fixez tous les cathéters et les câbles de la sonde de débit au site d’incision paracostale. Placez avec du ruban adhésif imperméable et suturez les cathéters à la peau de la brebis. Suturez une poche en filet en plastique à l’extérieur de la brebis sur les cathéters et sondez pour ranger les cathéters.
   1. À l’aide d’un matériau de suture synthétique résorbable monofilament 1-0, fixez la linea alba avec un motif continu. Fixez la couche de peau avec des agrafes chirurgicales.
4. Arrêtez l’anesthésie générale et extubez la brebis une fois que les réflexes laryngés sont revenus à la normale. Ne laissez pas l’animal sans surveillance jusqu’à ce qu’il ait repris conscience. Déplacez la brebis dans le chariot métabolique une fois qu’elle est stable après une anesthésie générale. Remettre l’animal dans la salle d’expérimentation postopératoire après s’être complètement remis de l’anesthésie.
5. Administrer des antalgiques postopératoires par voie intraveineuse (10 mg/kg/jour de phénylbutazone) pendant 3 jours. Rincer quotidiennement les cathéters vasculaires avec une solution saline héparinée (100 U/mL d’héparine dans une solution de NaCl à 0,9 %).

6. Expériences postopératoires in vivo

1. Rincez les cathéters tous les jours avec une solution saline héparinée (75 U/ml). Attendez 72 h avant de prendre des mesures. Pour mesurer le flux sanguin, connectez les sondes de débit insérées dans le fœtus avec le module de flux périvasculaire à PowerLab et à un ordinateur connecté.
   REMARQUE : Les enregistrements peuvent être effectués sur le logiciel PowerLab (voir Tableau des matériaux) pour mesurer le débit sanguin carotidien et fémoral. Prenez la mesure de base pendant 30 min.
2. Fixez les cathéters artériels et amniotiques à l’amplificateur de pont connecté à un convertisseur analogique-numérique (voir Tableau des matériaux). Administrer un bolus de 1 mL de phényléphrine 10 uM au fœtus par voie intraveineuse et mesurer le débit carotidien et fémoral pendant 15 min. Ensuite, attendez 30 minutes ou jusqu’à ce que le flux sanguin revienne à la normale.
3. Perfuser 1 mL de phényléphrine 10 uM dans le cathéter périvasculaire et mesurer le débit sanguin pendant 15 min. Laver la phényléphrine en administrant 5 mL de solution saline chaude par le cathéter périvasculaire. Ensuite, attendez 30 minutes ou jusqu’à ce que le flux sanguin revienne à la normale.

Pour examiner la manipulation localisée in vivo du flux sanguin, 1 mL de phényléphrine (10 μM), un agoniste α_{du 1-AR}, a été administré dans l’espace périvasculaire de l’artère carotide par un cathéter de perfusion extériorisé afin de déterminer l’effet sur le débit sanguin carotidien local et l’effet sur la pression artérielle systémique. La figure 1A montre une réduction significative du flux sanguin carotidien sans aucun effet sur la pression artérielle systémique chez les moutons fœtaux à court terme. La figure 1B montre les mêmes données pour un fœtus prématuré. L’administration de 1 mL de PHE par voie intraveineuse a augmenté le débit sanguin systémique sans affecter le flux sanguin carotidien chez les moutons fœtaux à court terme (figure 1C). La figure 1D montre les mêmes données pour un fœtus prématuré. En revanche, l’administration de PHE par un cathéter périvasculaire n’a eu aucun effet chez les moutons prématurés ; cependant, l’administration par voie intraveineuse a provoqué une augmentation significative du flux sanguin carotidien et de la pression artérielle systémique. Cette expérience démontre une sleeve périvasculaire entièrement fonctionnelle qui peut réguler le flux sanguin dans l’artère carotide in utero sans affecter la PA systémique. Les résultats montrent que les fœtus prématurés ne répondent pas à la régulation du flux sanguin carotidien médiée par la phényléphrine ; cependant, la réponse est mature chez les fœtus à court terme (figure 1E). Il est important de noter que l’administration IV de PHE n’a augmenté le flux sanguin carotidien que chez les fœtus prématurés, sans effet significatif chez les fœtus à court terme (Figure 1G). Cependant, l’administration IV de PHE a augmenté la pression artérielle systémique chez les fœtus prématurés et à court terme (Figure 1H). Les résultats démontrent également que l’instillation périvasculaire de phényléphrine n’a eu aucun effet sur la pression artérielle systémique (Figure 1F).

Figure 1 : Manipulation in vivo du flux sanguin. Une trace exemplaire de la pression artérielle systémique et du débit sanguin de l’artère carotide, des mesures de base et des changements après l’administration de phényléphrine (PHE) par le cathéter périvasculaire à partir (A) d’un fœtus in utero à court terme et (B) d’un fœtus prématuré in utero. Une trace exemplaire de la pression artérielle systémique et du débit sanguin de l’artère carotide, des mesures de base et des changements après l’administration intraveineuse de phényléphrine (PHE) à partir (C) d’un fœtus in utero à court terme et (D) d’un fœtus prématuré in utero. Les changements dans le pourcentage (E) du débit sanguin carotidien et (F) la pression artérielle systémique via le système d’administration par cathéter périvasculaire pour les moutons à court terme et prématurés sont montrés. Les changements dans le pourcentage (G) du débit sanguin carotidien et (H) la pression artérielle systémique via l’administration systémique pour les moutons à court terme et prématurés sont montrés. Les barres d’erreur montrent l’erreur type de la moyenne. N = 4 dans chaque groupe. *P < 0,05 par un test t de Student. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

À l’heure actuelle, il n’existe aucune méthode pour examiner la contractilité et la dilatation des vaisseaux in vivo en réponse à des composés médicamenteux et à la manipulation de gènes. En tant que norme dans le domaine, le débit sanguin in vivo est mesuré par des sondes de flux Doppler, des microsphères et des molécules radioactives telles que l’eau tritiée. Cependant, pour manipuler les fonctions des récepteurs ou la signalisation en aval, les animaux sont sacrifiés, et des expériences sont menées in vitro dans des bains d’organes après l’isolement des segments artériels. Les méthodes actuelles permettent d’effectuer des manipulations in vivo des segments artériels en introduisant des produits chimiques ou des vecteurs pour modifier l’expression des gènes. De plus, cette méthode a un effet minime sur la circulation systémique en raison de l’administration locale des agents.

Les expériences actuelles démontrent que l’administration de phényléphrine entraîne la constriction de l’artère carotide avec une réduction du flux sanguin. L’étude ci-dessus élucide le rôle des récepteurs alpha-adrénergiques dans la régulation du flux sanguin de l’artère carotide vers le cerveau. Cette technique peut être utilisée pour examiner l’effet de différents composés pharmacologiques sur le flux sanguin en temps réel chez les fœtus vivants. Le cathéter périvasculaire peut également être utilisé pour instiller le lentivirus dans l’espace périvasculaire, qui est absorbé par le système vasculaire, pour entraîner l’inactivation ou la surexpression de la protéine ou du récepteur de signalisation souhaité.

Pendant des décennies, les bains d’organes et de tissus ont fourni des données utiles sur la contractilité des vaisseaux ^6,8,9. Cependant, ces études sont ex vivo, ce qui soulève des questions quant à la reproductibilité in vivo et signifie que des mesures continues ne peuvent pas être effectuées. Pour surmonter cette limitation, cette approche innovante examine le flux sanguin de l’artère carotide in vivo. Une avancée supplémentaire dans cette méthodologie comprendra l’adoption de la modulation génétique à l’aide d’approches d’administration de virus, qui permettront aux segments artériels d’être génétiquement modifiés pour réguler à la hausse et à la baisse l’expression des gènes en délivrant shRNA ou CRISPR/Cas9.

L’étape critique du protocole consiste à placer le cathéter périvasculaire parallèlement au vaisseau à proximité. Pour que cela fonctionne, il faut connaître le diamètre de l’artère ciblée. De plus, il est important de développer un manchon approprié. On peut placer le manchon adjacent à l’artère à moduler au lieu de l’entourer. Cela permettra également la livraison locale des produits chimiques et des agents de ciblage.

La limite de la méthode est qu’elle ne régule qu’un segment de l’artère et que les résultats concernant le flux sanguin des organes ou des tissus doivent être interprétés avec prudence. Il peut être nécessaire de modifier la longueur du manchon et la quantité de produits chimiques pour obtenir l’effet souhaité. La méthode a de nombreuses applications dans la modulation de la régulation des gènes chez les fœtus vivants. Cela peut être adapté pour moduler la fonction et l’expression des gènes dans une partie de n’importe quel tissu. De plus, la méthode peut être appliquée pour moduler l’expression des gènes dans un organisme adulte.

Bien qu’il existe d’autres méthodes pour mesurer le flux sanguin in vivo , telles que l’utilisation de sondes de flux transsoniques¹⁰, laser Doppler¹¹ et microsphères¹², aucune de ces méthodes ne permet d’examiner l’effet local des médicaments sur le flux sanguin dans le segment artériel par opposition aux effets systémiques de l’intervention. Ainsi, la méthode actuelle est unique, car elle peut mesurer et moduler le flux sanguin local sans aucun effet systémique.