Isolatie en kwantificering van epstein-barrvirus uit de P3HR1-cellijn
Summary
Dit protocol maakt de isolatie van Epstein-Barr-virusdeeltjes uit de menselijke P3HR1-cellijn mogelijk bij het induceren van de virale lytische cyclus met phorbol 12-myristate 13-acetaat. DNA wordt vervolgens geëxtraheerd uit het virale preparaat en onderworpen aan real-time PCR om de virale deeltjesconcentratie te kwantificeren.
Abstract
Het Epstein-Barr-virus (EBV), formeel aangeduid als Humaan herpesvirus 4 (HHV-4), is het eerste geïsoleerde menselijke tumorvirus. Bijna 90-95% van de volwassen wereldbevolking is besmet met EBV. Met de recente vooruitgang in moleculaire biologie en immunologie heeft de toepassing van zowel in vitro als in vivo experimentele modellen diep en betekenisvol inzicht gegeven in de pathogenese van EBV bij veel ziekten en in EBV-geassocieerde tumorigenese. Het doel van dit gevisualiseerde experimenteerartikel is om een overzicht te geven van de isolatie van EBV-virale deeltjes uit cellen van de P3HR1-cellijn, gevolgd door kwantificering van het virale preparaat. P3HR1-cellen, oorspronkelijk geïsoleerd uit een humaan Burkitt-lymfoom, kunnen een P3HR1-virus produceren, een EBV-stam van type 2. De EBV-lytische cyclus kan in deze P3HR1-cellen worden geïnduceerd door behandeling met phorbol 12-myristate 13-acetaat (PMA), waardoor EBV-virale deeltjes ontstaan.
Met behulp van dit protocol voor de isolatie van EBV-deeltjes worden P3HR1-cellen gedurende 5 dagen gekweekt bij 37 °C en 5% CO2 in volledig RPMI-1640-medium met 35 ng / ml PMA. Vervolgens wordt het kweekmedium gedurende 8 minuten met een snelheid van 120 x g gecentrifugeerd om de cellen te pelleteren. Het virusbevattende supernatant wordt vervolgens verzameld en met een snelheid van 16.000 x g gedurende 90 minuten afgesponnen om de EBV-deeltjes te pelleteren. De virale pellet wordt vervolgens geresuspendeerd in een volledig RPMI-1640-medium. Dit wordt gevolgd door DNA-extractie en kwantitatieve real-time PCR om de concentratie van EBV-deeltjes in het preparaat te beoordelen.
Introduction
Het Epstein-Barr-virus (EBV) is het eerste menselijke tumorvirus dat is geïsoleerd1. EBV, formeel aangeduid als Humaan herpesvirus 4 (HHV-4)2, maakt deel uit van de gamma herpesvirus subfamilie van de herpesvirusfamilie en is het prototype van het lymfocryptovirus geslacht. Bijna 90-95% van de volwassen wereldbevolking is besmet met het virus3. In de meeste gevallen treedt de eerste infectie op binnen de eerste 3 jaar van het leven en is asymptomatisch, maar als de infectie later tijdens de adolescentie optreedt, kan dit aanleiding geven tot een ziekte die infectieuze mononucleosis4 wordt genoemd. EBV is in staat om rustende B-cellen te infecteren, waardoor ze proliferatieve B-lymfoblasten worden waarin het virus een latent geïnfecteerde toestand vestigt en handhaaft5. EBV kan op elk moment reactiveren en zo leiden tot terugkerende infecties6.
In de afgelopen 50 jaar is de associatie tussen sommige virussen en de ontwikkeling van menselijke maligniteiten steeds duidelijker geworden, en vandaag wordt geschat dat 15% tot 20% van alle menselijke kankers gerelateerd zijn aan virale infecties7. De herpesvirussen, waaronder EBV, zijn enkele van de best bestudeerde voorbeelden van dit soort tumorvirussen8. In feite kan EBV vele soorten menselijke maligniteiten veroorzaken, zoals Burkitt-lymfoom (BL), Hodgkin-lymfoom (HL), diffuus grootcellig B-cellymfoom en lymfoproliferatieve ziekten bij immuungecompromitteerde gastheren 9,10. Ebv is ook aangetoond geassocieerd te zijn met de ontwikkeling van systemische auto-immuunziekten. Enkele voorbeelden van deze auto-immuunziekten zijn reumatoïde artritis (RA), polymyositis-dermatomyositis (PM-DM), systemische lupus erythematosus (SLE), gemengde bindweefselziekte (MCTD) en het syndroom van Sjögren (SS)11. EBV wordt ook geassocieerd met de ontwikkeling van inflammatoire darmziekte (IBD)12.
Veel van deze ziekten kunnen worden bestudeerd of gemodelleerd met behulp van celkweek, muizen of andere organismen die zijn geïnfecteerd met EBV. Daarom zijn EBV-deeltjes nodig om cellen of organismen te infecteren, of het nu in vitro of in vivo modellenzijn 13,14,15,16, vandaar de noodzaak om een techniek te ontwikkelen die isolatie van virale deeltjes tegen lage kosten mogelijk maakt. Het hier beschreven protocol biedt richtlijnen voor een eenvoudige manier om EBV-deeltjes betrouwbaar te isoleren uit een relatief toegankelijke cellijn en om de deeltjes te kwantificeren met behulp van real-time PCR, dat kosteneffectief en direct beschikbaar is voor de meeste laboratoria. Dit in vergelijking met verschillende andere methoden die zijn beschreven om EBV te isoleren van verschillende cellijnen 17,18,19,20.
P3HR-1 is een BL-cellijn die groeit in suspensie en latent is geïnfecteerd met een EBV type 2-stam. Deze cellijn is een EBV-producent en kan worden geïnduceerd om virale deeltjes te produceren. Het doel van dit manuscript is om een methode te demonstreren die de isolatie van EBV-deeltjes uit de P3HR-1-cellijn mogelijk maakt, gevolgd door kwantificering van de virale voorraad die later kan worden gebruikt voor zowel in vitro als in vivo EBV-experimentele modellen.
Protocol
Representative Results
Discussion
De productie van EBV-deeltjes is noodzakelijk voor het begrijpen van de biologie van dit virus en de bijbehorende ziekten. Hier beschreven we de productie van deze deeltjes uit de P3HR-1 cellijn. Deze cellijn is niet de enige EBV-producentenlijn; in feite zijn EBV-deeltjes ook geïsoleerd uit B95-8-cellen21,22 en de Raji-cellijn18,19. De EBV-lytische cyclus is in deze cellen geïnduceerd met n-butyraat. A…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Financiering voor dit werk werd ondersteund door subsidies aan ER van het Asmar Research Fund, de Libanese Nationale Raad voor Wetenschappelijk Onderzoek (L-CNRS) en het Medical Practice Plan (MPP) aan de Amerikaanse Universiteit van Beiroet.
Materials
| 0.2 mL thin-walled PCR tubes | Thermo Scientific | AB0620 | Should be autoclaved before use |
| 0.2-10 µL Microvolume Filter Tips | Corning | 4807 | Should be autoclaved before use |
| 0.5-10 µL Pipette | BrandTech | 704770 | |
| 10 mL Disposable Serological Pipette | Corning | 4488 | |
| 1000 µL Filtered Pipette Tips | QSP | TF-112-1000-Q | |
| 100-1000 µL Pipette | Eppendorf | 3123000063 | |
| 100×20 mm Cuture Plates | Sarstedt | 83.1802 | |
| 10-100 µL Pipette | BrandTech | 704774 | |
| 15 mL Conical Tubes | Corning | 430791 | |
| 200 µL Filtered Pipette Tips | QSP | TF-108-200-Q | |
| 20-200 µL Pipette | Eppendorf | 3123000055 | |
| 50 mL Conical Tubes | Corning | 430828 | |
| CFX96 Real-Time C-1000 Thermal Cycler | Bio-Rad | 184-1000 | |
| DMSO | Amresco | 0231 | |
| DNase/RNase Free Water | Zymo Research | W1001-1 | |
| EBER Primers | Macrogen | N/A | Custom Made Primers |
| EBV DNA Control (Standards) | Vircell | MBC065 | |
| Ethanol (Laboratory Reagent Grade) | Fischer Chemical | E/0600DF/17 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | F9665 | |
| Fresco 21 MicroCentrifuge | Thermo Scientific | 10651805 | |
| Glycogen Solution | Qiagen | 158930 | |
| Hemocytometer | BOECO | BOE 01 | |
| Inverted Light Microscope | Zeiss | Axiovert 25 | |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 172-5121 | |
| Microcentrifuge Tube | Costar (Corning) | 3621 | Should be autoclaved before use |
| P3HR-1 Cell Line | ATCC | HTB-62 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Biowest | L0022 | |
| Phenol | VWR | 20599.297 | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma-Aldrich | P8139 | |
| Pipette Filler | Thermo Scientific | 9501 | |
| Precision Wipes | Kimtech | 7552 | |
| RPMI-1640 Culture Medium | Sigma | R7388 | |
| SL 16R Centrifuge | Thermo Scientific | 75004030 | |
| Sodium Acetate | Riedel-de Haën (Honeywell) | 25022 | |
| Spectrophotomer | DeNovix | DS-11 | |
| Tris-HCl | Sigma | T-3253 | |
| Trypan Blue Solution | Sigma | T8154 | |
| Water Jacketed CO2 Incubator | Thermo Scientific | 4121 |
Referenzen
- Epstein, M. A., Achong, B. G., Barr, Y. M. Virus particles in cultured lymphoblasts from Burkitt’s lymphoma. Lancet. 1 (7335), 702-703 (1964).
- Sample, J., et al. Epstein-Barr virus types 1 and 2 differ in their EBNA-3A, EBNA-3B, and EBNA-3C genes. Journal of Virology. 64 (9), 4084-4092 (1990).
- Chang, M. S., Kim, W. H. Epstein-Barr virus in human malignancy: a special reference to Epstein-Barr virus associated gastric carcinoma. Cancer Research and Treatment. 37 (5), 257-267 (2005).
- Manet, E., Schwab, M. . Encyclopedia of Cancer. , 1602-1607 (2017).
- Babcock, G. J., Decker, L. L., Volk, M., Thorley-Lawson, D. A. EBV persistence in memory B cells in vivo. Immunity. 9 (3), 395-404 (1998).
- Khan, G., Miyashita, E. M., Yang, B., Babcock, G. J., Thorley-Lawson, D. A. Is EBV persistence in vivo a model for B cell homeostasis. Immunity. 5 (2), 173-179 (1996).
- Jha, H. C., Banerjee, S., Robertson, E. S. The role of gammaherpesviruses in cancer pathogenesis. Pathogens. 5 (1), 18 (2016).
- El-Sharkawy, A., Al Zaidan, L., Malki, A. Epstein-Barr virus-associated malignancies: roles of viral oncoproteins in carcinogenesis. Frontiers in Oncology. 8, 265 (2018).
- Vereide, D., Sugden, B. Insights into the evolution of lymphomas induced by Epstein-Barr virus. Advances in Cancer Research. 108, 1-19 (2010).
- Vereide, D. T., Sugden, B. Lymphomas differ in their dependence on Epstein-Barr virus. Blood. 117 (6), 1977-1985 (2011).
- Houen, G., Trier, N. H. Epstein-Barr virus and systemic autoimmune diseases. Frontiers in Immunology. 11, 587380 (2020).
- Ortiz, A. N., et al. Impact of Epstein-Barr virus infection on inflammatory bowel disease (IBD) clinical outcomes. Revista Espanola de Enfermedades Digestivas. 114 (5), 259-265 (2021).
- Caplazi, P., et al. Mouse models of rheumatoid arthritis. Veterinary Pathology. 52 (5), 819-826 (2015).
- Kiesler, P., Fuss, I. J., Strober, W. Experimental models of inflammatory bowel diseases. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 1 (2), 154-170 (2015).
- Warde, N. Experimental arthritis: EBV induces arthritis in mice. Nature Reviews Rheumatology. 7 (12), 683 (2011).
- Jog, N. R., James, J. A. Epstein Barr virus and autoimmune responses in systemic lupus erythematosus. Frontiers in Immunology. 11, 623944 (2020).
- Shimizu, N., Yoshiyama, H., Takada, K. Clonal propagation of Epstein-Barr virus (EBV) recombinants in EBV-negative Akata cells. Journal of Virology. 70 (10), 7260-7263 (1996).
- Hsu, C. H., et al. Induction of Epstein-Barr virus (EBV) reactivation in Raji cells by doxorubicin and cisplatin. Anticancer Research. 22, 4065-4071 (2002).
- Nutter, L. M., Grill, S. P., Li, J. S., Tan, R. S., Cheng, Y. C. Induction of virus enzymes by phorbol esters and n-butyrate in Epstein-Barr virus genome-carrying Raji cells. Krebsforschung. 47 (16), 4407-4412 (1987).
- Fresen, K. O., Cho, M. S., zur Hausen, H. Recovery of transforming EBV from non-producer cells after superinfection with non-transforming P3HR-1 EBV. International Journal of Cancer. 22 (4), 378-383 (1978).
- Glaser, R., Tarr, K. L., Dangel, A. W. The transforming prototype of Epstein-Barr virus (B95-8) is also a lytic virus. International Journal of Cancer. 44 (1), 95-100 (1989).
- Sairenji, T., et al. Inhibition of Epstein-Barr virus (EBV) release from P3HR-1 and B95-8 cell lines by monoclonal antibodies to EBV membrane antigen gp350/220. Journal of Virology. 62 (8), 2614-2621 (1988).
- Savage, A., et al. An assessment of the population of cotton-top tamarins (Saguinus oedipus) and their habitat in Colombia. PLoS one. 11 (12), 0168324 (2016).
- Kallin, B., Klein, G. Epstein-Barr virus carried by raji cells: a mutant in early functions. Intervirology. 19 (1), 47-51 (1983).
- Fresen, K. O., Cho, M. S., Hausen, H. Z. Recovery of transforming EBV from non-producer cells after superinfection with non-transforming P3HR-1 EBV. International Journal of Cancer. 22 (4), 378-383 (1978).
- Bounaadja, L., Piret, J., Goyette, N., Boivin, G. Evaluation of Epstein-Barr virus, human herpesvirus 6 (HHV-6), and HHV-8 antiviral drug susceptibilities by use of real-time-PCR-based assays. Journal of Clinical Microbiology. 51 (4), 1244-1246 (2013).
- Buelow, D., et al. Comparative evaluation of four real-time PCR methods for the quantitative detection of Epstein-Barr virus from whole blood specimens. Journal of Molecular Diagnostics. 18 (4), 527-534 (2016).
- Wu, D. Y., Kalpana, G. V., Goff, S. P., Schubach, W. H. Epstein-Barr virus nuclear protein 2 (EBNA2) binds to a component of the human SNF-SWI complex, hSNF5/Ini1. Journal of Virology. 70 (9), 6020-6028 (1996).
- Li, C., et al. EBNA2-deleted Epstein-Barr virus (EBV) isolate, P3HR1, causes Hodgkin-like lymphomas and diffuse large B cell lymphomas with type II and Wp-restricted latency types in humanized mice. PLoS Pathogens. 16 (6), 1008590 (2020).
