Aislamiento y cuantificación del virus de Epstein-Barr de la línea celular P3HR1
Summary
Este protocolo permite el aislamiento de partículas del virus de Epstein-Barr de la línea celular humana P3HR1 al inducir el ciclo lítico viral con forbol 12-miristato 13-acetato. Posteriormente, el ADN se extrae de la preparación viral y se somete a PCR en tiempo real para cuantificar la concentración de partículas virales.
Abstract
El virus de Epstein-Barr (EBV), formalmente designado como Herpesvirus humano 4 (HHV-4), es el primer virus tumoral humano aislado. Casi el 90-95% de la población adulta del mundo está infectada por EBV. Con los recientes avances en biología molecular e inmunología, la aplicación de modelos experimentales in vitro e in vivo ha proporcionado una visión profunda y significativa de la patogénesis del VEB en muchas enfermedades, así como de la tumorigénesis asociada al VEB. El objetivo de este trabajo de experimento visualizado es proporcionar una visión general del aislamiento de partículas virales de EBV de células de la línea celular P3HR1, seguido de la cuantificación de la preparación viral. Las células P3HR1, originalmente aisladas de un linfoma de Burkitt humano, pueden producir un virus P3HR1, que es una cepa de EBV tipo 2. El ciclo lítico del VEB puede ser inducido en estas células P3HR1 mediante el tratamiento con forbol 12-miristato 13-acetato (PMA), produciendo partículas virales del VEB.
Utilizando este protocolo para el aislamiento de partículas de EBV, las células P3HR1 se cultivan durante 5 días a 37 °C y 5% deCO2 en medio RPMI-1640 completo que contiene 35 ng / ml PMA. Posteriormente, el medio de cultivo se centrifuga a una velocidad de 120 x g durante 8 min para granular las células. El sobrenadante que contiene el virus se recoge y se hace girar a una velocidad de 16.000 x g durante 90 minutos para granular las partículas de EBV. El pellet viral se resuspende en un medio RPMI-1640 completo. Esto es seguido por la extracción de ADN y la PCR cuantitativa en tiempo real para evaluar la concentración de partículas de VEB en la preparación.
Introduction
El virus de Epstein-Barr (VEB) es el primer virus tumoral humano que se ha aislado1. EBV, formalmente conocido como Herpesvirus humano 4 (HHV-4) 2, es parte de la subfamilia de virus del herpes gamma de la familia de virus del herpes y es el prototipo del género Lymphocryptovirus . Casi el 90-95% de la población adulta del mundo está infectada por el virus3. En la mayoría de los casos, la infección inicial ocurre dentro de los primeros 3 años de vida y es asintomática, sin embargo, si la infección ocurre más tarde durante la adolescencia, puede dar lugar a una enfermedad denominada mononucleosis infecciosa4. El VEB es capaz de infectar las células B en reposo induciéndolas a convertirse en linfoblastos B proliferativos en los que el virus establece y mantiene un estado de infección latente5. El VEB puede reactivarse en cualquier momento y, por lo tanto, provocar infecciones recurrentes6.
En los últimos 50 años, la asociación entre algunos virus y el desarrollo de neoplasias malignas humanas se ha vuelto cada vez más evidente, y hoy se estima que entre 15% y 20% de todos los cánceres humanos están relacionados con infecciones virales7. Los virus del herpes, incluido el VEB, son algunos de los ejemplos mejor estudiados de estos tipos de virus tumorales8. De hecho, el VEB puede causar muchos tipos de neoplasias malignas humanas, como el linfoma de Burkitt (BL), el linfoma de Hodgkin (LH), el linfoma difuso de células B grandes y las enfermedades linfoproliferativas en huéspedes inmunocomprometidos 9,10. También se ha demostrado que el VEB está asociado con el desarrollo de enfermedades autoinmunes sistémicas. Algunos ejemplos de estos trastornos autoinmunes son la artritis reumatoide (AR), la polimiositis-dermatomiositis (PM-DM), el lupus eritematoso sistémico (LES), la enfermedad mixta del tejido conectivo (MCTD) y el síndrome de Sjögren (SS)11. El VEB también está asociado con el desarrollo de la enfermedad inflamatoria intestinal (EII)12.
Muchas de estas enfermedades se pueden estudiar o modelar utilizando cultivos celulares, ratones u otros organismos que están infectados con EBV. Es por ello que se necesitan partículas de VEB para infectar células u organismos, ya sea in vitro o in vivo modelos 13,14,15,16, de ahí la necesidad de desarrollar una técnica que permita el aislamiento de partículas virales a bajo coste. El protocolo descrito aquí proporciona pautas para una manera fácil de aislar de manera confiable las partículas de EBV de una línea celular relativamente accesible y cuantificar las partículas utilizando PCR en tiempo real, que es rentable y fácilmente disponible para la mayoría de los laboratorios. Esto es en comparación con varios otros métodos que se han descrito para aislar el VEB de diferentes líneas celulares17,18,19,20.
P3HR-1 es una línea celular BL que crece en suspensión y está infectada latentemente con una cepa de EBV tipo 2. Esta línea celular es un productor de VEB y puede ser inducida a producir partículas virales. El objetivo de este manuscrito es mostrar un método que permita el aislamiento de partículas de VEB de la línea celular P3HR-1, seguido de la cuantificación del stock viral que luego podría usarse para modelos experimentales de VEB in vitro e in vivo .
Protocol
Representative Results
Discussion
La producción de partículas de VEB es necesaria para comprender la biología de este virus, así como sus enfermedades asociadas. Aquí describimos la producción de estas partículas a partir de la línea celular P3HR-1. Esta línea celular no es la única línea productora de VEB; de hecho, las partículas de EBV también se han aislado de las células B95-821,22, así como de la línea celular Raji18,19.<…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
La financiación para este trabajo fue apoyada por subvenciones a ER del Fondo de Investigación Asmar, el Consejo Nacional Libanés de Investigación Científica (L-CNRS) y el Plan de Práctica Médica (MPP) de la Universidad Americana de Beirut.
Materials
| 0.2 mL thin-walled PCR tubes | Thermo Scientific | AB0620 | Should be autoclaved before use |
| 0.2-10 µL Microvolume Filter Tips | Corning | 4807 | Should be autoclaved before use |
| 0.5-10 µL Pipette | BrandTech | 704770 | |
| 10 mL Disposable Serological Pipette | Corning | 4488 | |
| 1000 µL Filtered Pipette Tips | QSP | TF-112-1000-Q | |
| 100-1000 µL Pipette | Eppendorf | 3123000063 | |
| 100×20 mm Cuture Plates | Sarstedt | 83.1802 | |
| 10-100 µL Pipette | BrandTech | 704774 | |
| 15 mL Conical Tubes | Corning | 430791 | |
| 200 µL Filtered Pipette Tips | QSP | TF-108-200-Q | |
| 20-200 µL Pipette | Eppendorf | 3123000055 | |
| 50 mL Conical Tubes | Corning | 430828 | |
| CFX96 Real-Time C-1000 Thermal Cycler | Bio-Rad | 184-1000 | |
| DMSO | Amresco | 0231 | |
| DNase/RNase Free Water | Zymo Research | W1001-1 | |
| EBER Primers | Macrogen | N/A | Custom Made Primers |
| EBV DNA Control (Standards) | Vircell | MBC065 | |
| Ethanol (Laboratory Reagent Grade) | Fischer Chemical | E/0600DF/17 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | F9665 | |
| Fresco 21 MicroCentrifuge | Thermo Scientific | 10651805 | |
| Glycogen Solution | Qiagen | 158930 | |
| Hemocytometer | BOECO | BOE 01 | |
| Inverted Light Microscope | Zeiss | Axiovert 25 | |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 172-5121 | |
| Microcentrifuge Tube | Costar (Corning) | 3621 | Should be autoclaved before use |
| P3HR-1 Cell Line | ATCC | HTB-62 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Biowest | L0022 | |
| Phenol | VWR | 20599.297 | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma-Aldrich | P8139 | |
| Pipette Filler | Thermo Scientific | 9501 | |
| Precision Wipes | Kimtech | 7552 | |
| RPMI-1640 Culture Medium | Sigma | R7388 | |
| SL 16R Centrifuge | Thermo Scientific | 75004030 | |
| Sodium Acetate | Riedel-de Haën (Honeywell) | 25022 | |
| Spectrophotomer | DeNovix | DS-11 | |
| Tris-HCl | Sigma | T-3253 | |
| Trypan Blue Solution | Sigma | T8154 | |
| Water Jacketed CO2 Incubator | Thermo Scientific | 4121 |
Referenzen
- Epstein, M. A., Achong, B. G., Barr, Y. M. Virus particles in cultured lymphoblasts from Burkitt’s lymphoma. Lancet. 1 (7335), 702-703 (1964).
- Sample, J., et al. Epstein-Barr virus types 1 and 2 differ in their EBNA-3A, EBNA-3B, and EBNA-3C genes. Journal of Virology. 64 (9), 4084-4092 (1990).
- Chang, M. S., Kim, W. H. Epstein-Barr virus in human malignancy: a special reference to Epstein-Barr virus associated gastric carcinoma. Cancer Research and Treatment. 37 (5), 257-267 (2005).
- Manet, E., Schwab, M. . Encyclopedia of Cancer. , 1602-1607 (2017).
- Babcock, G. J., Decker, L. L., Volk, M., Thorley-Lawson, D. A. EBV persistence in memory B cells in vivo. Immunity. 9 (3), 395-404 (1998).
- Khan, G., Miyashita, E. M., Yang, B., Babcock, G. J., Thorley-Lawson, D. A. Is EBV persistence in vivo a model for B cell homeostasis. Immunity. 5 (2), 173-179 (1996).
- Jha, H. C., Banerjee, S., Robertson, E. S. The role of gammaherpesviruses in cancer pathogenesis. Pathogens. 5 (1), 18 (2016).
- El-Sharkawy, A., Al Zaidan, L., Malki, A. Epstein-Barr virus-associated malignancies: roles of viral oncoproteins in carcinogenesis. Frontiers in Oncology. 8, 265 (2018).
- Vereide, D., Sugden, B. Insights into the evolution of lymphomas induced by Epstein-Barr virus. Advances in Cancer Research. 108, 1-19 (2010).
- Vereide, D. T., Sugden, B. Lymphomas differ in their dependence on Epstein-Barr virus. Blood. 117 (6), 1977-1985 (2011).
- Houen, G., Trier, N. H. Epstein-Barr virus and systemic autoimmune diseases. Frontiers in Immunology. 11, 587380 (2020).
- Ortiz, A. N., et al. Impact of Epstein-Barr virus infection on inflammatory bowel disease (IBD) clinical outcomes. Revista Espanola de Enfermedades Digestivas. 114 (5), 259-265 (2021).
- Caplazi, P., et al. Mouse models of rheumatoid arthritis. Veterinary Pathology. 52 (5), 819-826 (2015).
- Kiesler, P., Fuss, I. J., Strober, W. Experimental models of inflammatory bowel diseases. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 1 (2), 154-170 (2015).
- Warde, N. Experimental arthritis: EBV induces arthritis in mice. Nature Reviews Rheumatology. 7 (12), 683 (2011).
- Jog, N. R., James, J. A. Epstein Barr virus and autoimmune responses in systemic lupus erythematosus. Frontiers in Immunology. 11, 623944 (2020).
- Shimizu, N., Yoshiyama, H., Takada, K. Clonal propagation of Epstein-Barr virus (EBV) recombinants in EBV-negative Akata cells. Journal of Virology. 70 (10), 7260-7263 (1996).
- Hsu, C. H., et al. Induction of Epstein-Barr virus (EBV) reactivation in Raji cells by doxorubicin and cisplatin. Anticancer Research. 22, 4065-4071 (2002).
- Nutter, L. M., Grill, S. P., Li, J. S., Tan, R. S., Cheng, Y. C. Induction of virus enzymes by phorbol esters and n-butyrate in Epstein-Barr virus genome-carrying Raji cells. Krebsforschung. 47 (16), 4407-4412 (1987).
- Fresen, K. O., Cho, M. S., zur Hausen, H. Recovery of transforming EBV from non-producer cells after superinfection with non-transforming P3HR-1 EBV. International Journal of Cancer. 22 (4), 378-383 (1978).
- Glaser, R., Tarr, K. L., Dangel, A. W. The transforming prototype of Epstein-Barr virus (B95-8) is also a lytic virus. International Journal of Cancer. 44 (1), 95-100 (1989).
- Sairenji, T., et al. Inhibition of Epstein-Barr virus (EBV) release from P3HR-1 and B95-8 cell lines by monoclonal antibodies to EBV membrane antigen gp350/220. Journal of Virology. 62 (8), 2614-2621 (1988).
- Savage, A., et al. An assessment of the population of cotton-top tamarins (Saguinus oedipus) and their habitat in Colombia. PLoS one. 11 (12), 0168324 (2016).
- Kallin, B., Klein, G. Epstein-Barr virus carried by raji cells: a mutant in early functions. Intervirology. 19 (1), 47-51 (1983).
- Fresen, K. O., Cho, M. S., Hausen, H. Z. Recovery of transforming EBV from non-producer cells after superinfection with non-transforming P3HR-1 EBV. International Journal of Cancer. 22 (4), 378-383 (1978).
- Bounaadja, L., Piret, J., Goyette, N., Boivin, G. Evaluation of Epstein-Barr virus, human herpesvirus 6 (HHV-6), and HHV-8 antiviral drug susceptibilities by use of real-time-PCR-based assays. Journal of Clinical Microbiology. 51 (4), 1244-1246 (2013).
- Buelow, D., et al. Comparative evaluation of four real-time PCR methods for the quantitative detection of Epstein-Barr virus from whole blood specimens. Journal of Molecular Diagnostics. 18 (4), 527-534 (2016).
- Wu, D. Y., Kalpana, G. V., Goff, S. P., Schubach, W. H. Epstein-Barr virus nuclear protein 2 (EBNA2) binds to a component of the human SNF-SWI complex, hSNF5/Ini1. Journal of Virology. 70 (9), 6020-6028 (1996).
- Li, C., et al. EBNA2-deleted Epstein-Barr virus (EBV) isolate, P3HR1, causes Hodgkin-like lymphomas and diffuse large B cell lymphomas with type II and Wp-restricted latency types in humanized mice. PLoS Pathogens. 16 (6), 1008590 (2020).
