Vi har tidigare utvecklat protokoll för Caenorhabditis elegans för att bilda kort- och långsiktiga associativa minnen genom masserad respektive distansträning. Här beskrivs detaljerade protokoll för konditionering av C. elegans genom att para ihop 1-propanol och saltsyra som konditionerade respektive okonditionerade stimuli för att bilda aversivt associativt minne.
Nematoden Caenorhabditis elegans är en attraktiv modellorganism för att studera inlärning och minne på molekylära och cellulära nivåer på grund av enkelheten i dess nervsystem, vars kemiska och elektriska kopplingsscheman rekonstruerades helt från seriella elektronmikrografer av tunna sektioner. Här beskriver vi detaljerade protokoll för konditionering av C. elegans genom mass- och distansträning för bildandet av korttidsminne (STM) respektive långtidsminne (LTM). Genom att para ihop 1-propanol och saltsyra som konditionerade respektive okonditionerade stimuli tränades C. elegans framgångsrikt för att bilda aversiv associativ STM och LTM. Medan naiva djur lockades till 1-propanol, var de utbildade djuren inte längre eller mycket svagt lockade till 1-propanol. Liksom i andra organismer som Aplysia och Drosophila spelar “inlärnings- och minnesgener” viktiga roller i minnesbildning. Särskilt krävs glutamatreceptorer av NMDA-typ, uttryckta i endast sex par interneuroner i C. elegans, för bildandet av både STM och LTM, möjligen som en slumpfaktor. Därför kan minnesspåret ligga bland interneuronerna.
Inlärning och minne är avgörande för att djur ska överleva och reproducera sig genom att effektivt navigera i föränderliga miljöer. C. elegans är en attraktiv modellorganism för att studera inlärning och minne på molekylär och cellulär nivå på grund av enkelheten i dess nervsystem, vars kemiska och elektriska kopplingsscheman rekonstruerades helt från seriella elektronmikrografer av tunna sektioner 1,2,3.
C. elegans lär sig att associera odlingstemperatur med svält och migrerar bort från sin tillväxttemperatur med ett aversivt minne som varar i flera timmar 4,5. Konditionering av C. elegans med natriumklorid (NaCl) i frånvaro av mat leder till en minskning av kemotaxi mot NaCl 6,7,8. I kombination med mat förbättras butanonattraktionen som ett resultat av aptitligt lärande 9,10,11. Även om dessa fenomen tolkas som associativt lärande och minne 10,12, är skillnaden mellan associativt lärande och icke-associativ sensibilisering, tillvänjning och anpassning inte tydlig i C. elegans inlärnings- och minnesparadigm13,14. Faktum är att djur konditionerade med butanon och matbrist (aversiv konditionering) visade deprimerad koppling av butanon sensorisk neuron AWC ON för att rikta neuroner genom insulinsignaler från andra neuroner, inklusive AIA-interneuroner, medan djur konditionerade med butanon och mat (aptitlig konditionering) visade förbättrad koppling av AWCON till målneuroner15 . Insulinsignaleringen orsakar genuttrycksförändringar inducerade av nukleär EGL-4 och andra transkriptionella regulatorer16,17. Således har detta aversiva och aptitliga lärande och minne analogier med icke-associativ tillvänjning respektive sensibilisering av presynaptiska sensoriska neuroner i gillabstinensreflexen i Aplysia18,19.
Genom att para ihop två kemikalier som konditionerad stimulans (CS) och okonditionerad stimulans (USA) har vi och andra utvecklat protokoll för konditionering av C. elegans för att bilda associativt lärande och minne utan att använda mat eller svält som USA20,21,22,23. I den aktuella studien modifieras protokollen för att konditionera djur med 1-propanol och saltsyra (HCl, pH 4.0) som CS respektive USA för aversiv inlärning och korttidsminne (STM) och långtidsminne (LTM). Naiv C. elegans lockas av 1-propanol24 och avvisas av syra25. När den konditionerades med en blandning av 1-propanol och HCl (pH 4,0) var C. elegans inte längre eller mycket svagt attraherad av 1-propanol.
I den aktuella studien hölls alla reagenser vid en RT på ~ 18 ° C i genomsnitt, och djur odlades på en bänk vid RT för att undvika stress för djuren. Dessutom utfördes alla försöksförfaranden vid RT. Djuren odlades först i en inkubator vid 20 °C och konditionerades sedan i en bänk vid ~24 °C med reagenser vid RT. Under dessa förhållanden var resultaten av konditioneringen mycket varierande. Vid låg RT växer C. elegans långsamt och bör odlas längre än vid 20 °C tills djuren når det mogna vuxenlivet, eftersom yngre vuxna djur är känsligare för de kemikalier som används för konditionering än mogna vuxna djur och kan visa lägre CI-värden.
Det mest kritiska steget för framgångsrik konditionering är tvättning av djur med ddH2O omedelbart efter varje kemisk behandling. Därför bör mekaniska påfrestningar och temperaturspänningar minimeras genom att använda sågade pipettspetsar, hålla reagenser vid RT och mycket försiktigt tvätta djuren genom att mycket långsamt flytta djuruppsamlaren upp och ner i ddH2O. Noggrann tvättning av djuren varje gång efter konditionering kan påverka inlärning och minne. Villkoren för kemotaxisanalysplattorna påverkar också resultaten allvarligt. För torra eller för våta plattor förhindrar jämn rörelse hos djuren. Plattorna bereddes enligt beskrivningen i steg 1. en bra platta är en för vilken de 4 μL-fläckarna av ddH2O eller 5% vattenhaltig 1-propanol absorberas fullständigt av agar på cirka 5 minuter efter spotting. Som beskrivits ovan är djuråldrar också avgörande för framgångsrik konditionering. Unga vuxna djur är känsliga för mekanisk och kemisk behandling, vilket resulterar i varierande resultat, även om mycket åldrade djur kanske inte heller är lämpliga för konditionering.
Hållbarheten för 1-propanol beror på märken och partier och är mindre än 3 månader vid RT. När CI-värdena hos naiva djur blir sämre, rekommenderas att använda färsk 1-propanol för konditionering och kemotaxianalys.
Minnesbildningen genom massträning påverkades inte av behandling av djur med translationshämmare (cykloheximid och anisomycin) och en transkriptionshämmare (aktinomycin D), medan minnesbildningen genom den åtskilda träningen hämmades markant av hämmarna20,21. Dessutom förföll det förra minnet av kallchock, medan det senare behölls under en längre period än det förra och var motståndskraftigt mot kallchock. Dessa resultat visar att den förra är STM och den senare är LTM respektive20,21. Minnet som bildas av massträningen kan dock bestå av STM och medeltidsminne (mellanperiodiskt) eftersom STM är svagt beroende av CREB-transkriptionsfaktorn (figur 5A). Detta överensstämmer med resultatet att STM behölls i mer än 1 h20,21. Bildandet av både STM och LTM är starkt beroende av nmr-1, vilket endast uttrycks i sex par neuroner (AVA, AVD, AVE, RIM, AVG och PVC) i C. elegans27,28. I dessa neuroner kan därför NMDA-receptorer fungera som en molekylär slumpdetektor av 1% vattenhaltiga 1-propanol- och HCl (pH 4.0) -signaler för synaptisk plasticitet, där den synaptiska förstärkningen som krävs för både STM och LTM kan bero på tillfällig avfyrning av pre- och postsynaptiska neuroner 29,30,31,32,33. Därför kan det aversiva associativa minnet bildas bland interneuronerna.
De metoder som beskrivs i denna studie bör vara tillämpliga för aptitlig luktinlärning och kortvarigt och långsiktigt associativt minne med 1-nonanol som CS och kaliumklorid som US21. Det är intressant att jämföra de neuronala kretsarna som är involverade i bildandet av aptitliga och aversiva minnen.
The authors have nothing to disclose.
Vi är tacksamma mot Takashi Murayama, Ei-ichiro Saita, Iou Ven Chang och Hitomi Ohtaki för deras tekniska hjälp och kommentarer till manuskriptet. Stammar tillhandahölls av Caenorhabditis Genetics Center, som finansieras av NIH National Center for Research Resources (NCRR). Detta arbete stöddes av finansiering från Okinawa Institute of Science and Technology Graduate University.
500 mL beaker | HARIO | B-500-H32 | |
10 µL pipette tips | Thermo Fisher Scientific | H-104-96RS-Q | |
0.2 mL pipette tips | Thermo Fisher Scientific | TTW110RS-Q | |
1.0 mL pipette tips | Thermo Fisher Scientific | H-111-R100NS-Q | |
1.5 mL plastic tubes | Eppendorf | 0030120086 | |
2 mL plastic tubes | Eppendorf | 0030120094 | |
10 mL Serological pipettes | As One | 2-5237-04 | |
50 mL Serological pipettes | As One | 2-5237-06 | |
6-well cell culture plate | Costar | 3516 | |
Aron Alpha (Glue for plastic) | Toagosei | High Speed EX | |
Autoclave | Tomy Digital Biology | SX-300 | |
Bacto agar | BD | 214010 | |
Bacto peptone | BD | 211677 | |
Bottle top 0.2 µm filter units | Thermo Fisher Scientific | 566-0020 | |
Bunsen burner | EISCO | SKU CH0089A | |
Calcium chloride dihydrate | Nacalai Tesque | 06730-15 | |
C. elegans mutant strains | Caenorhabditis Genetics Center | ||
Cholesterol | Wako Pure Chemical Industries | 034-03002 | |
Clear acrylic cylindrical pipe | Asahi Kasei | 3.5 cm (length), 30 mm (external diameter), 2 mm (thickness) | |
Crystallizing dish | Pyrex | 3140-80 | |
Dental burner | Phoenix-Dent | APT-3 | |
Di-potassium hydrogen phosphate | Nacalai Tesque | 28726-05 | |
E. coli OP50 | Caenorhabditis Genetics Center | ||
Electric pipetter | Drummond Scientific | 4-000-101 | |
Gelatin | Wako Pure Chemical Industries | 073-06295 | |
Glass Petri dishes (10 cm in diameter) | As One | Trade FLAT Mark | |
Heating magnetic stirrer | Thermo Fisher Scientific | SP131324 | |
Hydrochloric acid | Nacalai Tesque | 37345-15 | |
Incubator | SANYO | MIR-553 | |
Kimwipes S-200 | Nippon Paper Crecia | 62011 | |
Laboratory coat | TOYO LINT FREE | FH240C | |
Magnesium sulfate heptahydrate | Nacalai Tesque | 21002-85 | |
Magnetic stirrer bar | SANSYO | 93-5412 | |
Metal spatula | FUJIFILM Wako | 647-06531 | |
Nitrile gloves | Kimberly-Clark | KC100 | |
Nylon mesh (mesh size: 30 μm) | SEFAR | NY30-HD | |
P10 pipetman | Gilson | F144802 | |
P200 pipetman | Gilson | F123600 | |
P1000 pipetman | Gilson | F123602 | |
pH meter | HORIBA | Navi F-52 | |
Plastic Petri dishes (9 cm in diameter) | IWAKI | SH90-15E | |
Plastic Petri dishes (6 cm in diameter) | SARSTEDT | 82.1194.500 | |
Plastic weighing boats | As One | 1-5233-01 | |
Platinum wire for a worm pick | Nilaco | PT-351265 | |
1-Propanol | SIGMA-ALDRICH | 279544 | |
Potassium dihydrogen phosphate | Nacalai Tesque | 28721-55 | |
Safety goggles | Kimberly-Clark | #25646 | |
Sodium chloride | Nacalai Tesque | 31320-05 | |
Stereomicroscope | Olympus | SZX16 | |
Tooth picks | |||
Water purification sysytem | Merck | Elix Essential 10 UV | |
Water urification sysytem | Merck | Milli-Q Synthesis A10 | |
Weighing balance | METTLER | TOREDO | |
Wild type C. elegans strain N2 | Caenorhabditis Genetics Center |