Caenorhabditis elegans에서 두 가지 화학 물질을 짝을 지어 혐오스러운 연관 학습 및 기억 형성
Summary
우리는 이전에 Caenorhabditis elegans 가 각각 대량 및 간격 훈련을 통해 단기 및 장기 연관 기억을 형성하는 프로토콜을 개발했습니다. 여기에서는 1- 프로판올과 염산을 각각 조건 자극과 무조건 자극으로 짝을 지어 혐오 연관 기억을 형성함으로써 C. elegans 의 컨디셔닝에 대한 자세한 프로토콜을 설명합니다.
Abstract
선충류 Caenorhabditis elegans 는 신경계의 단순성으로 인해 분자 및 세포 수준에서 학습과 기억을 연구하는 매력적인 모델 유기체로, 화학 및 전기 배선도는 얇은 섹션의 연속 전자 현미경 사진으로 완전히 재구성되었습니다. 여기에서는 각각 단기 기억 (STM) 및 장기 기억 (LTM) 형성을위한 질량 및 간격 훈련에 의한 C. elegans 의 컨디셔닝에 대한 자세한 프로토콜을 설명합니다. 1- 프로판올과 염산을 각각 조건 자극과 무조건 자극으로 짝을 지어 C. elegans 는 혐오 연관 STM 및 LTM을 형성하도록 성공적으로 훈련되었습니다. 순진한 동물은 1- 프로판올에 끌리는 반면, 훈련 된 동물은 더 이상 또는 매우 약하게 1- 프로판올에 끌리지 않았습니다. Aplysia 와 Drosophila와 같은 다른 유기체와 마찬가지로 “학습 및 기억 유전자”는 기억 형성에 필수적인 역할을합니다. 특히, C. elegans에서 단지 6 쌍의 인터 뉴런에서만 발현되는 NMDA 형 글루타메이트 수용체는 STM과 LTM의 형성에 필요하며, 아마도 우연의 일치 인자로 필요합니다. 따라서 메모리 추적은 인터뉴런 사이에 존재할 수 있습니다.
Introduction
학습과 기억은 동물이 변화하는 환경을 효율적으로 탐색하여 생존하고 번식하는 데 필수적입니다. C. elegans는 신경계의 단순성으로 인해 분자 및 세포 수준에서 학습 및 기억을 연구하는 매력적인 모델 유기체로, 화학 및 전기 배선도는 얇은 섹션 1,2,3의 연속 전자 현미경 사진으로 완전히 재구성되었습니다.
C. elegans는 재배 온도를 기아와 연관시키는 법을 배우고 몇 시간 동안 지속되는 혐오 기억으로 성장 온도에서 멀어집니다 4,5. 컨디셔닝 C. 엘레 간스 음식이 없을 때 염화나트륨 (NaCl)은 NaCl 6,7,8에 대한 화학 주성을 감소시킵니다. 음식과 짝을 이루면 식욕학습 9,10,11의 결과로 부타논 매력이 향상됩니다. 이러한 현상은 연관 학습과 기억 10,12으로 해석되지만, 연관 학습과 비 연관 감작, 습관화 및 적응의 구별은 C. elegans 학습 및 기억 패러다임 13,14에서 명확하지 않습니다. 실제로, 부타논과 음식 부족으로 조절된 동물(혐오적 조건화)은 AIA 인터뉴런을 포함한 다른 뉴런의 인슐린 신호에 의해 표적 뉴런에 대한 부타논 감각 뉴런 AWC ON의 우울한 결합을 보인 반면, 부타논과 음식으로 조절된 동물(식욕 조건화)은 표적 뉴런에 대한 AWCON의 향상된 결합을 보여주었습니다15 . 인슐린 신호전달은 핵 EGL-4 및 다른 전사 조절인자(16,17)에 의해 유도된 유전자 발현 변화를 일으킨다. 따라서이 혐오적이고 식욕을 돋우는 학습과 기억은 Aplysia18,19의 아가미 금단 반사에서 시냅스 전 감각 뉴런의 비 연관 습관화 및 감작과 유사합니다.
조건 자극 (CS)과 무조건 자극 (미국)으로 두 가지 화학 물질을 결합함으로써, 우리와 다른 사람들은 C. elegans가 음식이나 기아를 사용하지 않고 연관 학습 및 기억을 형성하도록 조절하는 프로토콜을 개발했습니다 미국20,21,22,23. 본 연구에서, 프로토콜은 혐오 학습 및 단기 기억 (STM) 및 장기 기억 (LTM)을 위해 각각 CS와 US로서 1- 프로판올 및 염산 (HCl, pH 4.0)으로 동물을 조건화하도록 수정된다. 순진한 C. 엘레 간스는 1- 프로판올24에 의해 끌리고 산25에 의해 반발된다. 1- 프로판올과 HCl (pH 4.0)의 혼합물로 컨디셔닝했을 때, C. elegans는 더 이상 또는 매우 약하게 1- 프로판올에 끌리지 않았다.
Protocol
1. 조리법 NGM 한천 플레이트 (단계 2.1.)6cm NGM 플레이트를 준비하려면 2.5g의 펩톤, 3g의 NaCl 및 17g의 한천을 850mL의 이중 탈이온화된 H2O(ddH2O)에 용해시킵니다. ddH2O로 총 부피를 972 mL로 가져옵니다. 오토클레이빙 후 ~65°C로 냉각하고 에탄올에 용해된 5mg/mL 콜레스테롤 1mL, 1MCaCl2 및 1MMgSO4 각각 1mL, 1M 인산칼륨(pH 6.0) 25mL를 추가합니다. 잘 섞은 후 6cm(직경)의 페트리 접시에 각각 8mL씩 분주합니다. 뚜껑이있는 접시를 실온 (RT)의 벤치에 1 일 동안 보관 한 다음 사용할 때까지 차가운 방의 플라스틱 제품에 보관하십시오. 10 g의 트립톤, 5 g의 효모 추출물 및 10 g의 NaCl을 1 L의ddH2O에 용해시켜 Luria-Bertani (LB) 배지를 준비하고(단계 2.1.) 5 N NaOH(몇 방울)로 pH를 7.0으로 조정하고 오토클레이빙으로 멸균한다.LB 배지에 한천 15g을 추가하여 LB 플레이트를 준비합니다. 오토클레이빙 후 ~60°C로 식히고 각각 12mL를 9cm(직경) 페트리 접시에 분주합니다. 사용할 때까지 차가운 방에서 플라스틱 제품에 접시를 보관하십시오. 동물 수집기 (2.4 단계)를 만들려면 나일론 메쉬 (30μm 메쉬 크기)를 접착제로 투명 아크릴 원통형 파이프 (길이 3.5cm, 외경 3cm, 벽 두께 2mm)의 바닥에 부착하십시오. 0.25 % 젤라틴 수용액을 만들려면 (단계 2.4.), 0.25g의 젤라틴을 100mL의 ddH2O에 녹입니다. 화학주성 분석 플레이트(단계 5.1.)화학주성 분석용 한천 플레이트를 만들려면 오토클레이빙에 의해 993mL의ddH2O에 한천 15g을 녹이고 용액을 ~65°C로 냉각합니다. 이어서, 5 mL의 오토클레이브된 1 M 인산칼륨(pH 6.0), 1 MCaCl2 1 mL, 및 1 MMgSO4 1 mL를 한천 용액에 첨가한다. 이 모든 용액은 오토 클레이빙에 의해 별도로 멸균됩니다. 혼합 용액 10mL를 6cm 페트리 접시에 분주합니다. 뚜껑이 있는 이 접시를 RT의 벤치에 이틀 동안 놓은 다음 사용할 때까지 RT의 플라스틱 제품에 젖은 종이 타월에 올려 놓습니다. 이 플레이트는 최대 10 일 동안 사용할 수 있습니다. 화학주성 분석 완충액을 만들기 위해(단계 5.4.), 1M 인산칼륨(pH 6.0) 5mL, 1MCaCl2 1mL, 1M MgSO4 1mL 및 ddH2O993mL를 혼합한다. 40 mL CS/US 혼합 용액 (1% 수성 1-프로판올 및 HCl[pH 4.0])을 만들기 위해(단계 3.1. 및 단계 4.1.), 0.4 mL의 절대 1-프로판올 및 4 μL의 5 M HCl (최종 농도에서 0.1 mM)을 39.6 mL의ddH2O에 첨가한다. ddH2O를 만들려면 수돗물을 정수 시스템으로 2x 처리하십시오 ( 재료 표 참조). 이쑤시개로 신선한 콜로니를 LB 배지 10mL에 접종하고 37°C에서 7-8시간 동안 배양하여 대장균 OP50의 액체 배양(OD600 = ~0.7)을 준비합니다. 더 오랜 기간 동안 배양 된 박테리아는 아마도 2 차 대사 산물로 인해 컨디셔닝 결과에 영향을 미칠 수 있습니다. 2. 동기화 된 C의 제조. 엘레 간스 표준 방법26을 사용하여 6cm NGM 플레이트에서 동물을 재배합니다 (단계 1.1). NGM 플레이트는 0.2mL의 대장균 OP50 액체 배양물을 LB 배지에 퍼뜨리고(단계 1.9 참조) RT에서 24시간 이하로 배양하여 준비합니다(오래된 박테리아가 컨디셔닝 결과에 영향을 미칠 수 있음).알림: C. elegans 학습 및 기억은 기계적, 화학적 및 온도 스트레스에 매우 민감합니다. 따라서 동물을 사육하고 물을 포함한 모든 시약을 유지하며 17 ° C에서 20 ° C 사이의 RT에서 모든 분석을 수행하는 것이 좋습니다. 와류, 거친 피펫팅 및 원심분리와 같은 물리적 및 기계적 자극은 피해야 합니다. 신선한 1- 프로판올은 알 수없는 이유로 3 개월마다 사용해야합니다. 중요한 것은 기아가 컨디셔닝의 결과에 심각한 영향을 미칠 수 있으므로 동물을 충분한 음식으로 재배해야 한다는 것입니다. 1 일째에 백금 벌레 피커로 4 개의 6cm NGM 플레이트 각각에 잘 먹은 중력 동물 5 마리 (천천히 알을 낳는 돌연변이 동물을 더 많이 넣음)를 골라서 놓고 RT에서 3 시간 동안 ~ 50 개의 알을 낳게하여 동기화 된 성인 동물 개체군을 얻습니다. 백금 벌레 피커로 접시에서 부모 동물을 제거하여 알을 낳는 것을 중지하십시오.알림: 파종 된 플레이트는 동물에 대한 스트레스를 최소화하기 위해 RT로 유지해야합니다. 동물이 젊은 성인 단계가 아닌 성숙한 성인 단계에 도달하는 데 걸리는 시간 인 약 5 일 동안 RT에서 동물을 재배하십시오.알림: 4.5일에서 5.5일 사이의 재배 기간은 어린 성체 동물이 성숙한 성체 동물보다 컨디셔닝에 사용되는 화학 물질에 더 민감하기 때문에 조건에 따라 조정되어야 합니다(보충 그림 1). 컨디셔닝 후, 어린 성인 동물은 더 낮은 화학 주성 지수 (CI) 값을 나타낼 수 있습니다. 동물 수집기에서 ~ 200 마리의 성인 동물을 수집합니다 (1.4 단계 참조). 각 플레이트를 0.25 % 수성 젤라틴 1mL로 세척합니다 (단계 1.4). 이 수성 젤라틴은 피펫 팁과 같은 플라스틱 표면에 동물이 부착되는 것을 방지합니다. ~10mL의 ddH2O에서 수집기를 2배 위아래로 매우 부드럽게 움직여 수집기 내의 동물을ddH2O(단계 1.8)로 세척합니다. 박테리아 오염을 방지하기 위해 각각 ~10mL의ddH2O로 이 과정을 2배 더(총 3배) 반복합니다.알림: 박테리아 오염은 동물의 화학 주성에 심각한 영향을 미칩니다. 3. 단기 연관 학습 및 기억을위한 대량 교육 참고: 대량 훈련 워크플로에 대해서는 그림 1 을 참조하십시오. ~1-프로판올과 HCl(4.0-프로판올과 혼합한 후 pH 1.7 참조)의 혼합물 40mL에 ~1마리의 동물이 들어 있는 동물 수집기를 결정화 접시에 ~1초 동안 부드럽게 담그십시오.알림: 대조 동물의 경우 동일한 작업을 수행하되 1% 수성 1-프로판올에만 담그십시오. HCl (pH 4.0)로 동물을 다른 대조군으로 만 치료하는 것이 좋습니다. 동물을 6-웰 조직 배양 플레이트의 웰에 10 mL의ddH2O중 1x 콜렉터에 매우 부드럽게 침지시켜 콜렉터에서 세척한다.알림: 이 세척 단계는 매우 부드러워야 하며 광범위한 세척은 학습을 방해할 수 있으므로 1회만 수행해야 합니다. 3.1단계를 반복합니다. 및 3.2. 중단 없이 10배(시험 간 간격[ITI], 0분).알림: RT에서 매번 신선한 ddH2O를 사용하십시오. 동물이 휴식을 취할 수 있도록 수집 기를 50cm NGM 플레이트의 6cm NGM 플레이트에 놓고 RT에서 10분 동안 놓습니다. ~10mL의 ddH2O에서 수집기를 2배 위아래로 매우 부드럽게 움직여ddH2O로 수집기 내의 동물을 세척합니다. 박테리아 오염을 방지하기 위해 각각 ~10mL의ddH2O로 이 과정을 2배 더(총 3배) 반복합니다. 하기와 같이 화학주성 분석을 진행한다(단계 5). 4. 장기 연관 학습 및 기억을위한 간격 교육 참고: 간격 훈련 워크플로에 대해서는 그림 2 를 참조하십시오. ~1-프로판올과 HCl(1-프로판올과 혼합한 후 pH 4.0, 1.7단계 참조)의 혼합물 40mL에 ~1.0마리의 동물이 들어 있는 동물 수집기를 결정화 접시에 ~1.0초 동안 부드럽게 담그십시오.알림: 대조군으로 만 1 % 수성 1- 프로판올로 동일하게 수행하십시오. HCl (pH 4.0)로 동물을 다른 대조군으로 만 치료하는 것이 좋습니다. 동물을 6-웰 조직 배양 플레이트의 웰에 10 mL의ddH2O중 1x 콜렉터에 매우 짧게 침지시켜 콜렉터에서 세척한다.알림: 이 세척은 광범위한 세척으로 인해 학습이 방해될 수 있으므로 매우 간단해야 합니다. 수집기를 NGM 한천 플레이트의 대장균 OP50 잔디밭에 놓고 6cm (직경) 페트리 접시에 RT에서 10 분 동안 놓아 동물이 휴식을 취할 수 있도록합니다.참고: ITI는 동물이 LTM 형성을 위한 기억을 통합하는 데 중요하므로 10분 동안 휴식을 취합니다. 4.1.-4.3단계를 반복합니다. 10배. RT에 보관되는 ddH2O의 ~10mL에서 수집기를 2배 위아래로 매우 부드럽게 움직여 수집기 내의 동물을ddH2O로 세척합니다.박테리아 오염을 방지하기 위해 각각 ~10mL의ddH2O로 이 과정을 2배 더(총 3배) 반복합니다. 하기와 같이 화학주성 분석을 진행한다(단계 5). 5. 화학주성 분석 6cm 플라스틱 페트리 접시에서 화학 주성 분석을위한 한천 플레이트를 준비하십시오 (1.5 단계 참조). 플라스틱 페트리 접시 뚜껑의 평평한 표면에 놓인 수집기 (단계 2.5)에서 동물을 >1mm (내경) 개구부가있는 톱질 된 피펫 팁을 사용하여 0.25 % 수성 젤라틴 1mL가있는 2mL 마이크로 원심 분리 튜브로 옮깁니다.알림: 동물에 대한 전단 응력을 최소화하기 위해 잘린 피펫 팁을 사용하는 것이 중요합니다. 동물이 ~1분 동안 중력에 의해 튜브 바닥에 침전된 후 튜브에서 상청액을 제거합니다(원심분리하지 않음). 화학주성 분석 버퍼 1mL에 동물을 부드럽게 재현탁시키고(1.6단계 참조) 중력에 의해 튜브 바닥에 ~1분 동안 가라앉히도록 합니다(원심분리하지 않음). 피펫팅으로 가능한 한 많은 상청액을 제거합니다. 한편, 도 3A에 도시된 바와 같이, 동일한 방법으로 두 곳에서 5% 수성 1-프로판올의 4 μL 및 다른 두 장소에서 각각 4 μL의ddH2O를 대각선으로 스팟한다. 1-프로판올에 대한 민감도가 낮은 돌연변이체의 화학주성 분석의 경우, 보충 표 1에 표시된 바와 같이 순진한 돌연변이체의 화학주성 지수(CI) 값이 ~0.6인 더 높은 농도의 수성 1-프로판올을 발견합니다.알림: 가능한 한 빨리 스포팅 절차를 완료하는 것이 중요합니다. 스팟 5% 수성 1-프로판올 이후 1% 수성 1-프로판올은 화학주성 분석에서 동물을 유인하기에는 너무 약하다. 대조적으로, 1 %보다 높은 농도의 수성 1- 프로판올로 처리 된 동물은 더 낮은 CI 값을 나타내기 때문에 컨디셔닝을 위해 1 % 수성 1- 프로판올을 사용하십시오. ~1.0mm(내경) 개구부가 있는 톱질된 피펫 팁을 사용하여 화학주성 분석을 위해 3개의 플레이트 중앙에 ~60마리의 동물을 포함하는 화학주성 분석 버퍼(단계 5.4)에서 동물 현탁액의 6μL 부분을 스팟합니다. 동물을 만지지 않고 실험실 조직 심지로 가능한 한 액체를 제거하고 접시에 뚜껑을 놓습니다.참고: 가능한 한 빨리 이러한 절차를 완료하는 것이 중요합니다. 동물들이 RT에서 10 분 동안 접시 위에서 자유롭게 움직일 수있게 한 다음, 접시를 얼음 위의 유리 페트리 접시에 3 분 동안 옮겨 화학 주성을 멈 춥니 다. 그런 다음 접시에있는 동물의 수를 셀 때까지 접시를 냉장고에 보관하십시오. 실체 현미경으로 중심 원에있는 동물을 제외한 4 개의 섹션에서 동물의 수를 계산하고 그림 3B에 표시된 방정식을 사용하여 화학 주성 지수 (CI)를 계산합니다. CI 값에서 학습 지수(L.I.) 값을 기준 동물의 CI 값과 조건화된 동물의 CI 값 간의 차이로 계산합니다(L.I. = CI 참조- CI 조건화).참고: 기준 동물의 CI 값(CI 참조)은 1% 수성 1-프로판올로만 조절된 동물의 CI 값의 평균값입니다.
Representative Results
C. elegans는 1 % 수성 1- 프로판올과 HCl (pH 4.0)을 각각 CS와 US로 쌍을 이루어 단기 혐오 연관 기억을 형성하기 위해 대량 훈련에 의해 조절되었습니다. 상기 기재된 프로토콜에 따라, 동기화된 동물을 5일 동안 18°C의 RT에서 벤치 상에서 배양하고, 18°C의 RT에서ddH2O로 2x 매우 부드럽게 세척하였다. 이어서, 동물을 1 s 동안 1% 수성 1-프로판올 및 HCl (pH 4.0)의 혼합물로 컨디셔닝하였다. 또한 ddH2O 만, 1 % 수성 1- 프로판올 만, HCl (pH 4.0)만을 기준으로 동물을 훈련시켰다. 컨디셔닝 후, 동물을ddH2O로 1x 세척하였다. 중단 없이 컨디셔닝을 10회 반복했습니다(ITI 없음). 성공적인 컨디셔닝은 절차를 7x 이상에서 최대 10x 반복하여 달성되었습니다. 컨디셔닝이 10배 이상이면 학습 효율성이 떨어졌습니다 21. 훈련 후, 동물을 RT(18°C)에서 10분 동안 박테리아 음식 위에 쉬게 하였다. ddH2O3x로 세척된 후, 동물을 0.25% 수성 젤라틴에 현탁시킴으로써 미세원심분리 튜브로 옮기고, 중력에 의해 바닥으로 침전시켰다. 가능한 한 상청액을 제거한 후, 동물을 화학주성 분석 완충액에 부드럽게 재현탁시킨 다음, 중력에 의해 튜브의 바닥까지 침전되도록 하였다. 가능한 한 많은 상청액을 제거한 후, 동물 현탁액을 화학주성 분석 플레이트의 중심 원 상에 발견하고, 이를 18°C의 RT로 유지한 다음, 동물을 18°C의 RT에서 10분 동안 플레이트 상에서 자유롭게 이동하도록 허용하였다. CI 값은 도 3B에 도시된 방정식을 사용하여 계산하였다. 도 4A에 도시된 바와 같이, 1% 1-프로판올 및 HCl의 혼합물로 조건화된 동물은 화학주성 분석을 위해 한천 플레이트 상에 발견된 5% 1-프로판올에 더 이상 끌리지 않는 반면, 나이브 및 기준 동물은 유사하게 5% 1-프로판올에 끌렸다. 매스 훈련 후 (단계 3.), 기억은 3 h20 이내에 더 이상 관찰되지 않았다. 또한, 대량 훈련에 의해 형성된 기억은 차가운 충격(20)에 민감했다. 이러한 결과는 C. elegans 가 대량 훈련을 통해 혐오 STM을 성공적으로 형성했음을 보여줍니다. 동물은 또한 훈련 단계 사이에 10분 ITI를 갖는 10x 간격 훈련에 의해 컨디셔닝되었다(단계 4.). ITI 동안, 동물을 가진 수집기를 18°C의 RT에서 6cm NGM 플레이트 상의 박테리아 잔디 상에 놓았다. 1% 수성 1-프로판올 및 HCl(pH 4.0)의 혼합물을 사용한 이격 훈련에 의해 조절된 동물은 1% 1-프로판올 단독, HCl(pH 4.0) 단독, 또는ddH2O만으로 처리된 동물에 비해 더 이상 5% 1-프로판올에 끌리지 않았다(도 4B). 이격 훈련 후, 동물들은 12 h20,21 이상 동안 기억을 유지했다. 또한, 동물을 번역 또는 전사 억제제로 치료했을 때 기억이 형성되지 않았으며 차가운 쇼크20,21에 내성이있었습니다. 따라서 C. elegans는 간격 훈련을 통해 혐오 LTM을 성공적으로 형성했습니다. 우리는 또한 STM과 LTM의 형성에 대한 “학습 및 기억 유전자”의 돌연변이의 영향을 조사했습니다. crh-1 유전자는 유비쿼터스 전사 인자 cAMP- 반응 요소 결합 단백질 (CREB), glr-1 및 nmr-1은 α- 아미노 -3- 하이드 록실 -5- 메틸 -4- 이속 사졸 프로피온산 (AMPA) 유형 및 N- 메틸 -D- 아스 파르 테이트 (NMDA) 유형 글루타메이트 수용체 서브 유닛을 각각 암호화하고, stau-1은 이중 가닥 RNA 결합 단백질 Staufen 이소형을 암호화합니다. 이 유전자는 C. elegans, Drosophila, Aplysia 및 생쥐의 고전적 조건화에 필수적인 역할을합니다. 1% 수성 1-프로판올과 HCl(pH 4.0)의 혼합물을 사용하여, STM 및 LTM의 형성은 모든 유전자에 의존적이었다(도 5A,B). 그림 1: 대량 훈련의 실험 도식. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 그림 2: 간격 훈련의 실험 도식. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 그림 3: 화학주성 분석 및 화학주성 지수. (A) 화학주성 분석 플레이트의 개략적 표현. 페트리 접시 (직경 6cm)를 도시된 바와 같이 4개의 영역으로 분리하고, 각각 4μL의 5% 수성 1-프로판올 또는ddH2O를 중앙으로부터 2cm 떨어진 두 곳에서 각각 대각선으로 발견하였다. (b) 화학주성 지수 값은 화학주성 완료 후 영역 “a” 및 “b”에서 동물의 수를 세어 나타낸 방정식으로부터 계산하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 그림 4: 화학 물질로 조절된 동물의 화학주성 지수 값. 동기화된 야생형 N2 동물은 (A) 집단 훈련 10x 또는 (B) 이격 훈련 10x로 표시된 화학물질로 컨디셔닝하였다. 사용된 질량 및 간격 훈련 프로토콜의 순서도는 각각 그림 1과 그림 2에 나와 있습니다. 컨디셔닝 후, 동물을 18°C의 RT에서 화학주성 분석을 위해 6 cm 한천 플레이트 상에서 10분 동안 자유롭게 이동시켰다. CI 값은 도 3B에 도시된 방정식을 사용하여 계산하였다. 이 그림에 대한 데이터는 보충 표 1에 제공됩니다. 순진한 동물의 데이터는 두 그림 패널에서 다시 그려졌습니다. 막대 그림은 제1 사분위수, 중위수 및 제3 사분위수를 보여줍니다. 별표(*P < 0.05)는 일원 분산 분석에 이어 Dunnett의 다중 비교 검정에 의해 결정된 통계적으로 유의한 차이를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 그림 5: 조건화된 돌연변이 동물의 학습 지수 값. 동기화된 야생형 N2 및 지시된 돌연변이 동물은 (A) 매스트레이닝 10x 또는 (B) 이격트레이닝 10x에 의해 1% 수성 1-프로판올 및 HCl(pH 4.0)의 혼합물로 컨디셔닝하였다. 사용된 질량 및 간격 훈련 프로토콜의 순서도는 각각 그림 1 과 그림 2에 나와 있습니다. 컨디셔닝 후, 동물을 18°C의 RT에서 화학주성 분석을 위해 6 cm 한천 플레이트 상에서 10분 동안 자유롭게 이동시켰다. 이 그림에 대한 데이터는 보충 표 2에 제공됩니다. 막대 그림은 제1 사분위수, 중위수 및 제3 사분위수를 보여줍니다. 별표(*P < 0.05)는 일원 분산 분석에 이어 Dunnett의 다중 비교 검정에 의해 결정된 통계적으로 유의한 차이를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 보충 그림 1: 젊은 성인 동물은 화학 처리에 민감합니다. 부화 4일째 및 5일째 야생형 N2 동물을 중단 없이 HCl, pH 4.0으로 10x 대량 훈련시킨 다음, 화학주성을 5% 수성 1-프로판올로 검정하였다. 막대는 S.E.M.(n = 19)± 의미합니다. 별표(*P < 0.05)는 양방향 분산 분석에 이어 Tukey-Kramer 사후 검정에 의해 결정된 통계적으로 유의한 차이를 나타냅니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오. 보충 표 1: 그림 4에 해당하는 데이터. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오. 보충 표 2: 그림 5에 해당하는 데이터. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
본 연구에서, 모든 시약은 평균 ~ 18 °C의 RT에서 유지되었고, 동물은 동물에 대한 스트레스를 피하기 위해 RT의 벤치에서 재배되었다. 또한, 모든 실험 절차는 RT에서 수행되었다. 동물은 초기에 20°C의 인큐베이터에서 배양된 다음, RT에서 시약을 사용하여 ~24°C의 벤치에서 컨디셔닝하였다. 이러한 조건에서 컨디셔닝의 결과는 매우 다양했습니다. 낮은 RT에서 C. elegans는 천천히 자라며 어린 성인 동물이 성숙한 성인 동물보다 컨디셔닝에 사용되는 화학 물질에 더 민감하고 더 낮은 CI 값을 나타낼 수 있기 때문에 동물이 성숙한 성체 단계에 도달 할 때까지 20 ° C보다 오래 재배해야합니다.
성공적인 컨디셔닝을위한 가장 중요한 단계는 각 화학 처리 직후에 ddH2O로 동물을 세척하는 것입니다. 따라서, 톱질된 피펫 팁을 사용하고, 시약을 RT에 유지하고,ddH2O에서 동물 수집기를 위아래로 매우 천천히 움직여 동물을 매우 부드럽게 세척함으로써 기계적 및 온도 응력을 최소화해야 한다. 컨디셔닝 후 매번 동물을 철저히 세척하면 학습과 기억에 영향을 미칠 수 있습니다. 화학주성 분석 플레이트의 조건도 결과에 심각한 영향을 미칩니다. 너무 건조하거나 너무 젖은 판은 동물의 부드러운 이동을 방해합니다. 플레이트를 단계 1에 기재된 바와 같이 제조하였다.; 좋은 플레이트는 ddH2O 또는 5 % 수성 1- 프로판올의 4 μL 반점이 발견 후 약 5 분 안에 한천에 완전히 흡수되는 플레이트입니다. 위에서 설명한 것처럼 동물의 나이도 성공적인 컨디셔닝에 중요합니다. 젊은 성인 동물은 기계적 및 화학적 처리에 민감하여 다양한 결과를 초래하지만 매우 나이가 많은 동물도 컨디셔닝에 적합하지 않을 수 있습니다.
1-프로판올의 유통 기한은 브랜드와 로트에 따라 다르며 RT에서 3개월 미만입니다. 순진한 동물의 CI 값이 악화되면 컨디셔닝 및 화학 주성 분석을 위해 신선한 1- 프로판올을 사용하는 것이 좋습니다.
대량 훈련에 의한 기억의 형성은 번역 억제제 (시클로 헥시 미드 및 아니 소 마이신) 및 전사 억제제 (악티노 마이신 D)로 동물을 치료함으로써 영향을받지 않은 반면, 간격 훈련에 의한 기억의 형성은 억제제20,21에 의해 현저하게 억제되었다. 또한 전자의 기억은 콜드 쇼크에 의해 쇠퇴 한 반면, 후자는 전자보다 더 오랜 기간 동안 유지되어 콜드 쇼크에 강했습니다. 이 결과는 전자가 STM이고 후자가 LTM임을 각각20,21로 보여줍니다. 그러나 대량 훈련에 의해 형성된 기억은 STM이 CREB 전사 인자에 약하게 의존하기 때문에 STM과 중기(중기) 기억으로 구성될 수 있습니다(그림 5A). 이는 STM이 1시간20,21 이상 유지된 결과와 일치합니다. STM과 LTM의 형성은 C. elegans27,28에서 6 쌍의 뉴런 (AVA, AVD, AVE, RIM, AVG 및 PVC)에서만 발현되는 nmr-1에 크게 의존합니다. 따라서, 이들 뉴런에서, NMDA 수용체는 시냅스 가소성에 대한 1% 수성 1-프로판올 및 HCl(pH 4.0) 신호의 분자 일치 검출기로서 작용할 수 있으며, 여기서 STM 및 LTM 모두에 필요한 시냅스 강화는 시냅스 전 및 시냅스 후 뉴런(29,30,31,32,33)의 우연한 발사로부터 발생할 수 있다. 따라서, 혐오 연관 기억은 인터 뉴런 사이에서 형성 될 수있다.
본 연구에 기술된 방법은 CS로서 1-노나놀 및 US21로서 염화칼륨을 사용하는 식욕 후각 학습 및 단기 및 장기 연관 기억에 적용될 수 있어야 한다. 식욕을 돋우는 기억과 혐오스러운 기억의 형성에 관여하는 신경 회로를 비교하는 것은 흥미 롭습니다.
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
무라야마 타카시, 사이타 에이이치로, 이우 벤 창, 오타키 히토미의 기술 지원과 원고에 대한 의견에 감사드립니다. 균주는 NIH 국립 연구 자원 센터 (NCRR)가 자금을 지원하는 Caenorhabditis Genetics Center에서 제공했습니다. 이 연구는 오키나와 과학 기술 대학원 대학의 자금 지원으로 지원되었습니다.
Materials
| 500 mL beaker | HARIO | B-500-H32 | |
| 10 µL pipette tips | Thermo Fisher Scientific | H-104-96RS-Q | |
| 0.2 mL pipette tips | Thermo Fisher Scientific | TTW110RS-Q | |
| 1.0 mL pipette tips | Thermo Fisher Scientific | H-111-R100NS-Q | |
| 1.5 mL plastic tubes | Eppendorf | 0030120086 | |
| 2 mL plastic tubes | Eppendorf | 0030120094 | |
| 10 mL Serological pipettes | As One | 2-5237-04 | |
| 50 mL Serological pipettes | As One | 2-5237-06 | |
| 6-well cell culture plate | Costar | 3516 | |
| Aron Alpha (Glue for plastic) | Toagosei | High Speed EX | |
| Autoclave | Tomy Digital Biology | SX-300 | |
| Bacto agar | BD | 214010 | |
| Bacto peptone | BD | 211677 | |
| Bottle top 0.2 µm filter units | Thermo Fisher Scientific | 566-0020 | |
| Bunsen burner | EISCO | SKU CH0089A | |
| Calcium chloride dihydrate | Nacalai Tesque | 06730-15 | |
| C. elegans mutant strains | Caenorhabditis Genetics Center | ||
| Cholesterol | Wako Pure Chemical Industries | 034-03002 | |
| Clear acrylic cylindrical pipe | Asahi Kasei | 3.5 cm (length), 30 mm (external diameter), 2 mm (thickness) | |
| Crystallizing dish | Pyrex | 3140-80 | |
| Dental burner | Phoenix-Dent | APT-3 | |
| Di-potassium hydrogen phosphate | Nacalai Tesque | 28726-05 | |
| E. coli OP50 | Caenorhabditis Genetics Center | ||
| Electric pipetter | Drummond Scientific | 4-000-101 | |
| Gelatin | Wako Pure Chemical Industries | 073-06295 | |
| Glass Petri dishes (10 cm in diameter) | As One | Trade FLAT Mark | |
| Heating magnetic stirrer | Thermo Fisher Scientific | SP131324 | |
| Hydrochloric acid | Nacalai Tesque | 37345-15 | |
| Incubator | SANYO | MIR-553 | |
| Kimwipes S-200 | Nippon Paper Crecia | 62011 | |
| Laboratory coat | TOYO LINT FREE | FH240C | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Nacalai Tesque | 21002-85 | |
| Magnetic stirrer bar | SANSYO | 93-5412 | |
| Metal spatula | FUJIFILM Wako | 647-06531 | |
| Nitrile gloves | Kimberly-Clark | KC100 | |
| Nylon mesh (mesh size: 30 μm) | SEFAR | NY30-HD | |
| P10 pipetman | Gilson | F144802 | |
| P200 pipetman | Gilson | F123600 | |
| P1000 pipetman | Gilson | F123602 | |
| pH meter | HORIBA | Navi F-52 | |
| Plastic Petri dishes (9 cm in diameter) | IWAKI | SH90-15E | |
| Plastic Petri dishes (6 cm in diameter) | SARSTEDT | 82.1194.500 | |
| Plastic weighing boats | As One | 1-5233-01 | |
| Platinum wire for a worm pick | Nilaco | PT-351265 | |
| 1-Propanol | SIGMA-ALDRICH | 279544 | |
| Potassium dihydrogen phosphate | Nacalai Tesque | 28721-55 | |
| Safety goggles | Kimberly-Clark | #25646 | |
| Sodium chloride | Nacalai Tesque | 31320-05 | |
| Stereomicroscope | Olympus | SZX16 | |
| Tooth picks | |||
| Water purification sysytem | Merck | Elix Essential 10 UV | |
| Water urification sysytem | Merck | Milli-Q Synthesis A10 | |
| Weighing balance | METTLER | TOREDO | |
| Wild type C. elegans strain N2 | Caenorhabditis Genetics Center |
Referenzen
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Diesen Artikel zitieren
Shibutani, M., Vibulyaseck, S., Maruyama, I. N. Aversive Associative Learning and Memory Formation by Pairing Two Chemicals in Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (184), e64137, doi:10.3791/64137 (2022).