JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Ergebnisse
Discussion
Offenlegungen
Acknowledgements
Materials
Referenzen
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Neurowissenschaften

Caenorhabditis elegans'ta İki Kimyasalın Eşleştirilmesiyle Engelleyici İlişkisel Öğrenme ve Hafıza Oluşumu

Published: June 23, 2022
doi:
10.3791/64137
, ,
1Information Processing Biology Unit,Okinawa Institute of Science and Technology Graduate University

Summary

Daha önce Caenorhabditis elegans’ın sırasıyla kitlesel ve aralıklı eğitim yoluyla kısa ve uzun vadeli ilişkisel anılar oluşturması için protokoller geliştirdik. Burada, C. elegans’ın koşullandırılması için, 1-propanol ve hidroklorik asidi, sırasıyla koşullu ve koşulsuz uyaranlar olarak eşleştirerek, engelleyici ilişkisel hafıza oluşturmak için ayrıntılı protokoller açıklanmaktadır.

Abstract

Nematod Caenorhabditis elegans , kimyasal ve elektriksel kablolama şemaları ince kesitlerin seri elektron mikrograflarından tamamen yeniden yapılandırılmış olan sinir sisteminin basitliği nedeniyle moleküler ve hücresel seviyelerde öğrenme ve hafızayı incelemek için çekici bir model organizmadır. Burada, sırasıyla kısa süreli bellek (STM) ve uzun süreli bellek (LTM) oluşumu için kütleli ve aralıklı eğitim ile C. elegans’ın koşullandırılması için ayrıntılı protokolleri açıklıyoruz. 1-propanol ve hidroklorik asidi sırasıyla şartlandırılmış ve koşulsuz uyaranlar olarak eşleştirerek, C. elegans önleyici ilişkisel STM ve LTM oluşturmak için başarıyla eğitildi. Naif hayvanlar 1-propanole çekilirken, eğitimli hayvanlar artık 1-propanole çekilmiyordu veya çok zayıf bir şekilde çekiliyordu. Aplysia ve Drosophila gibi diğer organizmalarda olduğu gibi, “öğrenme ve hafıza genleri” hafıza oluşumunda önemli roller oynar. Özellikle, C. elegans’ta sadece altı çift internöronda eksprese edilen NMDA tipi glutamat reseptörleri, muhtemelen bir tesadüf faktörü olarak hem STM hem de LTM’nin oluşumu için gereklidir. Bu nedenle, hafıza izi internöronlar arasında bulunabilir.

Introduction

Öğrenme ve hafıza, hayvanların değişen ortamlarda verimli bir şekilde gezinerek hayatta kalmaları ve üremeleri için hayati öneme sahiptir. C. elegans, kimyasal ve elektriksel kablolama şemaları ince bölümler 1,2,3’ün seri elektron mikrograflarından tamamen yeniden yapılandırılan sinir sisteminin basitliği nedeniyle moleküler ve hücresel seviyelerde öğrenme ve hafızayı incelemek için çekici bir model organizmadır.

C. elegans, yetiştirme sıcaklığını açlıkla ilişkilendirmeyi öğrenir vebirkaç saat süren 4,5 saatlik bir hafıza ile büyüme sıcaklığından uzaklaşır. C. elegans’ın gıda yokluğunda sodyum klorür (NaCl) ile koşullandırılması, kemotaksiste NaCl 6,7,8’e doğru bir azalmaya yol açar. Yiyeceklerle eşleştirildiğinde, iştah açıcı öğrenmenin bir sonucu olarak butanon çekiciliği artar 9,10,11. Her ne kadar bu fenomenler ilişkisel öğrenme ve hafıza 10,12 olarak yorumlansa da, ilişkisel öğrenme ile ilişkisel olmayan duyarlılaşma, alışkanlık ve adaptasyon arasındaki ayrım C. elegans öğrenme ve hafıza paradigması13,14’te açık değildir. Gerçekten de, butanon ve gıda yoksunluğu (aversif koşullandırma) ile şartlandırılmış hayvanlar, AIA internöronları da dahil olmak üzere diğer nöronlardan gelen insülin sinyalleri ile nöronları hedeflemek için butanon duyusal nöronAWC ON’un depresif eşleşmesini gösterirken, butanon ve gıda ile şartlandırılmış hayvanlar (iştah açıcı koşullandırma), nöronları hedeflemek için AWCON’un gelişmiş eşleşmesini gösterdi15 . İnsülin sinyalizasyonu, nükleer EGL-4 ve diğer transkripsiyonel düzenleyiciler16,17 tarafından indüklenen gen ekspresyon değişikliklerine neden olur. Bu nedenle, bu engelleyici ve iştah açıcı öğrenme ve hafıza, sırasıyla Aplysia 18,19’daki solungaç-yoksunluk refleksindeki presinaptik duyusal nöronların ilişkisel olmayan alışkanlığı ve duyarlılaşması ile benzerliklere sahiptir.

İki kimyasalı koşullu uyaran (CS) ve koşulsuz uyaran (ABD) olarak eşleştirerek, biz ve diğerleri, C. elegans’ın ABD 20,21,22,23 gibi yiyecek veya açlık kullanmadan ilişkisel öğrenme ve hafıza oluşturmak için şartlandırılması için protokoller geliştirdik. Bu çalışmada, protokoller, aversif öğrenme ve kısa süreli hafıza (STM) ve uzun süreli hafıza (LTM) için sırasıyla CS ve US olarak 1-propanol ve hidroklorik asit (HCl, pH 4.0) ile hayvanları koşullandıracak şekilde değiştirilmiştir. Naif C. elegans 1-propanol 24 tarafından çekilir ve asit25 tarafından püskürtülür. 1-propanol ve HCl (pH 4.0) karışımı ile şartlandırıldığında, C. elegans artık 1-propanole çekilmedi veya çok zayıf bir şekilde çekildi.

Protocol

1. Yemek tarifleri NGM agar plakaları (adım 2.1.)6 cm NGM plakaları hazırlamak için, 2.5 g pepton, 3 g NaCl ve 17 g agar, 850 mL çift deiyonize H2O (ddH2O) içinde çözün. ddH 2 O ile toplam hacmi972 mL’yegetirin. Otoklavlamadan sonra, ~ 65 ° C’ye kadar soğutun ve etanol içinde çözünmüş 1 mL 5 mg / mL kolesterol, 1 M CaCl2 ve 1 M MgSO4’ün her biri 1 mL ve 25 mL 1 M potasyum fosfat (pH 6.0) ekleyin. İyice karıştırdıktan sonra, her biri 6 cm (çapında) Petri kaplarına 8 mL dağıtın. Kapaklı plakaları 1 gün boyunca oda sıcaklığında (RT) bir tezgahta tutun ve daha sonra kullanana kadar soğuk bir odada plastik eşyalarda saklayın. 10 g tripton, 5 g maya ekstresi ve 10 g NaCl’yi 1 L ddH 2 O’da çözerek Luria-Bertani (LB) ortamını (adım2.1.) hazırlayın.LB ortamına 15 g agar ekleyerek LB plakalarını hazırlayın. Otoklavlamadan sonra, ~ 60 ° C’ye kadar soğutun ve her biri 9 cm (çapında) Petri kaplarına 12 mL dağıtın. Plakaları kullanana kadar plastik eşyalarda soğuk bir odada saklayın. Bir hayvan toplayıcı yapmak için (adım 2.4.), şeffaf bir akrilik silindirik borunun dibine (3,5 cm uzunluğunda, dış çapı 3 cm, duvar kalınlığında 2 mm) tutkalla naylon örgü (30 μm ağ boyutu) takın. % 0.25 sulu jelatin çözeltisi (adım 2.4.) yapmak için, 0.25 g jelatini 100 mL ddH2O’da çözün. Kemotaksi tahlil plakaları (adım 5.1.)Kemotaksis testi için agar plakaları yapmak için, otoklavlama ile 993 mL ddH2O’da 15 g agar’ı çözün ve çözeltiyi ~ 65 ° C’ye soğutun. Daha sonra, agar çözeltisine 5 mL otoklavlanmış 1 M potasyum fosfat (pH 6.0), 1 mL 1 M CaCl2 ve 1 mL 1 M MgSO4 ekleyin. Tüm bu çözeltiler otoklavlama ile ayrı ayrı sterilize edilir. Karışık çözeltinin 10 mL’sini 6 cm’lik bir Petri kabına dağıtın. Bu kapaklı plakaları iki gün boyunca RT’deki bir bankın üzerine yerleştirin ve daha sonra kullanana kadar RT’de plastik eşyalarda ıslak kağıt havlulara koyun. Bu plakalar 10 güne kadar kullanılabilir. Kemotaksis tahlil tamponu yapmak için (adım 5.4.), 5 mL 1 M potasyum fosfat (pH 6.0), 1 mL 1 M CaCl 2, 1 mL 1 M MgSO4 ve 993 mL ddH2O karıştırın. 40 mL CS/US karışım çözeltisi (% 1 sulu 1-propanol ve HCl [pH 4.0]) (adım 3.1. ve adım 4.1.) yapmak için, 0.4 mL mutlak 1-propanol ve 4 μL 5 M HCl (son konsantrasyonda 0.1 mM) ekleyin. ddH 2 O yapmak için, musluk suyunu su arıtma sistemleriyle2kat arıtın (Malzeme Tablosuna bakınız). Taze bir koloniyi kürdanla10 mL LB ortamına aşılayarak ve 7-8 saat boyunca 37 ° C’de inkübe ederek Escherichia coli OP50’nin sıvı kültürünü (OD 600 = ~ 0.7) hazırlayın. Daha uzun süre yetiştirilen bakteriler, belki de ikincil metabolitler nedeniyle şartlanmanın sonucunu etkileyebilir. 2. Senkronize C’nin hazırlanması  elegans Standart yöntemler26’yı kullanarak, hayvanları 6 cm’lik NGM plakaları üzerinde yetiştirin (adım 1.1.). NGM plakaları, LB ortamında 0.2 mL’lik bir E. coli OP50 sıvı kültürünün yayılmasıyla (bkz. adım 1.9 .) ve RT’de en fazla 24 saat boyunca inkübe edilerek hazırlanır (eski bakteriler şartlandırmanın sonucunu etkileyebilir).NOT: C. elegans öğrenme ve hafıza mekanik, kimyasal ve sıcaklık streslerine karşı son derece hassastır. Bu nedenle, hayvanların yetiştirilmesi, su dahil tüm reaktiflerin bakımı ve RT’de tüm testlerin 17 ° C ile 20 ° C arasında yapılması şiddetle tavsiye edilir. Girdap, kaba pipetleme ve santrifüjleme gibi fiziksel ve mekanik stimülasyonlardan kaçınılmalıdır. Taze 1-propanol, bilinmeyen bir nedenden dolayı en uzun süre her 3 ayda bir kullanılmalıdır. Daha da önemlisi, hayvanlar bol miktarda yiyecekle yetiştirilmelidir, çünkü açlık şartlanmanın sonucunu ciddi şekilde etkileyebilir. 1. günde, platin solucan toplayıcı ile dört adet 6 cm’lik NGM plakasının her birine beş iyi beslenmiş gravid hayvanı (yavaşça yumurta bırakan daha fazla mutant hayvan koyun) alın ve yerleştirin ve senkronize bir yetişkin hayvan popülasyonu elde etmek için RT’de 3 saat boyunca ~ 50 yumurta bırakmalarına izin verin. Bir platin solucan toplayıcı ile ana hayvanları plakalardan çıkararak yumurtlamayı durdurun.NOT: Hayvanlara stresi en aza indirmek için tohumlu plakalar RT’de tutulmalıdır. RT’deki hayvanları yaklaşık 5 gün boyunca yetiştirin, bu da hayvanların genç yetişkin aşamasına değil, olgun yetişkin aşamalarına ulaşmaları için gereken süredir.NOT: 4,5 gün ile 5,5 gün arasındaki yetiştirme süresi, koşullara bağlı olarak ayarlanmalıdır, çünkü genç yetişkin hayvanlar, şartlandırma için kullanılan kimyasallara olgun yetişkin hayvanlardan daha hassastır (Ek Şekil 1). Koşullandırmadan sonra, genç yetişkin hayvanlar daha düşük kemotaksi indeksi (CI) değerleri gösterebilir. Her bir plakayı 1 mL% 0.25 sulu jelatin (adım 1.4.) ile yıkayarak bir hayvan toplayıcısında ~ 200 yetişkin hayvan toplayın (adım 1.4.) Bu sulu jelatin, hayvanların pipet uçları gibi plastiklerin yüzeyine yapışmasını önler. Kollektördeki hayvanları ddH 2 O (adım 1.8.) ile çok nazikçe yukarı ve aşağı hareket ettirerek ~10 mL ddH2O ile yıkayın.NOT: Bakteriyel kontaminasyon, hayvanların kemotaksisini ciddi şekilde etkiler. 3. Kısa süreli ilişkisel öğrenme ve hafıza için kitle eğitimi NOT: Toplu eğitim iş akışı için Şekil 1’e bakın. ~200 hayvan içeren hayvan toplayıcıyı, %1 1-propanol ve HCl (1-propanol ile karıştırıldıktan sonra pH 4.0; bkz. adım 1.7.) karışımının 40 mL’sine ~1 sn kristalize edici bir kaba nazikçe batırın.NOT: Kontrol hayvanları için de aynısını yapın, ancak sadece% 1 sulu 1-propanole daldırın. HCl’li (pH 4.0) hayvanları sadece başka bir kontrol olarak tedavi etmek daha iyi olacaktır. Kollektör 1x’i 10 mL ddH2O’ya 6 delikli bir doku kültürü plakasının bir kuyusuna çok nazikçe batırarak toplayıcıdaki hayvanları yıkayın.NOT: Bu yıkama adımı çok nazik olmalı ve kapsamlı yıkama öğrenmeyi engelleyebileceğinden sadece 1x yapılmalıdır. 3.1 numaralı adımları yineleyin. ve 3.2. Kesintisiz 10x (denemeler arası aralık [ITI], 0 dk).NOT: RT’de her seferinde taze ddH2O kullanın. Toplayıcıyı, hayvanların dinlenmesi için RT’de 10 dakika boyunca 6 cm’lik bir NGM plaka üzerinde bir E. coli OP50 çim üzerine yerleştirin. Kollektörü ~10 mL ddH 2O’da 2x yukarı ve aşağı hareket ettirerek toplayıcıdaki hayvanları ddH 2 O ile yıkayın. Bakteriyel kontaminasyonu önlemek için bu işlemi her biri ~10 mL ddH2O ile2xdaha fazla (toplamda 3x) tekrarlayın. Aşağıda açıklandığı gibi kemotaksis testine geçin (adım 5). 4. Uzun süreli ilişkisel öğrenme ve hafıza için aralıklı eğitim NOT: Aralıklı eğitim iş akışı için Şekil 2’ye bakın. ~200 hayvan içeren bir hayvan toplayıcıyı, 40 mL’lik bir karışım içinde% 1-1-propanol ve HCl (1-propanol ile karıştırıldıktan sonra pH 4.0; bkz. adım 1.7.) içinde ~ 1.0 s kristalize edici bir kaba yavaşça batırın.NOT: Aynı şeyi sadece kontrol olarak %1 sulu 1-propanol ile yapın. HCl’li (pH 4.0) hayvanları sadece başka bir kontrol olarak tedavi etmek daha iyi olacaktır. Kollektör 1x’i 10 mL’lik ddH2O’ya 6 delikli bir doku kültürü plakasının bir kuyusuna çok kısa bir süre batırarak toplayıcıdaki hayvanları yıkayın.NOT: Bu yıkama çok kısa olmalıdır, çünkü kapsamlı yıkama öğrenmeyi engelleyebilir. Toplayıcıyı, hayvanların dinlenmesi için RT’de 10 dakika boyunca 6 cm (çapında) Petri kabında bir NGM agar plakası üzerine bir E. coli OP50 çimi üzerine yerleştirin.NOT: ITI olarak 10 dakika dinlenmek, hayvanların LTM’nin oluşumu için anıları pekiştirmeleri için çok önemlidir. 4.1.-4.3 arasındaki adımları yineleyin. 10x. Kollektördeki hayvanları, toplayıcıyı RT’de tutulan ddH2O’nun ~10 mL’sinde 2x yukarı ve aşağı doğru çok nazikçe hareket ettirerek ddH 2 O ile yıkayın. Bakteriyel kontaminasyonu önlemek için bu işlemi her biri ~10 mL ddH 2 O ile2xdaha fazla (toplamda 3x) tekrarlayın. Aşağıda açıklandığı gibi kemotaksis testine geçin (adım 5.). 5. Kemotaksi testi 6 cm’lik plastik Petri kaplarında kemotaksis testi için agar plakaları hazırlayın (bkz. adım 1.5.). Plastik bir Petri kabı kapağının düz bir yüzeyine yerleştirilen toplayıcıdaki hayvanları (adım 2.5.), >1 mm (iç çaplı) açıklığa sahip kesilmiş bir pipet ucu kullanarak, 1 mL’lik %0,25 sulu jelatin içeren 2 mL’lik bir mikrosantrifüj tüpe aktarın.NOT: Hayvanlar üzerindeki kesme stresini en aza indirmek için kesilmiş pipet ucu kullanmak önemlidir. Hayvanlar ~ 1 dakika boyunca yerçekimi ile tüpün dibine yerleştikten sonra süpernatantı tüpten çıkarın (santrifüj yapmayın). Hayvanları 1 mL kemotaksis tahlil tamponunda nazikçe askıya alın (bkz. adım 1.6.) ve ~ 1 dakika boyunca yerçekimi ile tüpün dibine yerleşmelerine izin verin (santrifüj yapmayın). Pipetleme ile mümkün olduğunca fazla süpernatant çıkarın. Bu arada, Şekil 3A’da gösterildiği gibi, iki yerde% 5 sulu 1-propanolün her biri% 5 sulu 1-propanol’un her biri 4 μL’yi çapraz olarak ve diğer iki yerde ddH2O’nun her birini aynı şekilde noktalayın. 1-propanole karşı daha düşük duyarlılığa sahip mutantların kemotaksis testi için, Ek Tablo 1’de gösterildiği gibi, naif mutantların ~0.6 kemotaksi indeksi (CI) değerleriyle sonuçlanan daha yüksek sulu 1-propanol konsantrasyonlarını tespit edin.NOT: Lekeleme prosedürlerini mümkün olduğunca çabuk tamamlamak önemlidir. Spot% 5 sulu 1-propanol çünkü% 1 sulu 1-propanol, kemotaksis testinde hayvanları çekmek için çok zayıftır. Buna karşılık, şartlandırma için% 1 sulu 1-propanol kullanın, çünkü% 1’den daha yüksek sulu 1-propanol konsantrasyonları ile muamele edilen hayvanlar daha düşük CIA değerleri gösterir. Kemotaksis tahlili tamponundaki hayvan süspansiyonunun 6 μL kısımlarını (adım 5.4.), ~ 1.0 mm (iç çaplı) açıklığa sahip kesilmiş bir pipet ucu kullanarak kemotaksis testi için üç plakanın merkezinde ~60 hayvan içerir. Hayvanlara dokunmadan bir laboratuvar doku fitili ile sıvıyı mümkün olduğunca çıkarın ve plakaya bir kapak yerleştirin.NOT: Bu prosedürleri mümkün olduğunca çabuk tamamlamak önemlidir. RT’de hayvanların 10 dakika boyunca plaka üzerinde serbestçe hareket etmelerine izin verin ve ardından kemotaksisi durdurmak için plakayı 3 dakika boyunca buz üzerinde bir cam Petri kabına aktarın. Ardından, plakadaki hayvan sayısını sayana kadar tabağı buzdolabında saklayın. Bir stereomikroskop altında, merkez dairedekiler hariç, dört bölümdeki hayvan sayısını sayın ve Şekil 3B’de gösterilen denklemi kullanarak kemotaksis indeksini (CI) hesaplayın. M.D. değerlerinden, öğrenme indeksi (L.I.) değerlerini, referans hayvanların C.I. değeri ile şartlandırılmış hayvanların C.I. değeri arasındaki fark olarak hesaplayın (L.I. = C.I.reference- C.I.conditioned).NOT: Referans hayvanların (C.I.reference) C.I. değeri, sadece %1 sulu 1-propanol ile koşullandırılmış hayvanların C.I. değerlerinin ortalama değeridir.

Representative Results

C. elegans , sırasıyla% 1 sulu 1-propanol ve HCl’yi (pH 4.0) CS ve US olarak eşleştirerek kısa süreli aversif ilişkisel hafıza oluşturmak için kitlesel eğitim ile şartlandırıldı. Yukarıda açıklanan protokole göre, senkronize hayvanlar 5 gün boyunca 18 ° C’lik bir RT’de bir tezgahta yetiştirildi ve 18 ° C’lik bir RT’de ddH 2 O ile2xçok nazikçe yıkandı. Daha sonra, hayvanlar 1 s için% 1 sulu 1-propanol ve HCl (pH 4.0) karışımı ile şartlandırıldı. Ayrıca sadece ddH2O, sadece %1 sulu 1-propanol ve HCl (pH 4.0) ile sadece referans olarak hayvanları eğittik. Şartlandırmadan sonra, hayvanlar ddH2O ile 1x yıkandı. Koşullandırmayı 10x kesintisiz olarak tekrarladık (ITI yok). Başarılı koşullandırma, prosedürün 7x’ten 10x’e kadar tekrarlanmasıyla elde edildi. 10 kattan fazla koşullanma, daha az verimli öğrenme ile sonuçlandı21. Eğitimden sonra, hayvanlar RT’de (18 ° C) 10 dakika boyunca bakteriyel yiyecekler üzerinde dinlendi. ddH2O 3x ile yıkandıktan sonra, hayvanlar% 0.25 sulu jelatin içinde askıya alınarak bir mikrosantrifüj tüpüne aktarıldı ve yerçekimi ile dibe çöktü. Süpernatantı mümkün olduğunca çıkardıktan sonra, hayvanlar kemotaksis tahlil tamponunda yavaşça yeniden askıya alındı ve daha sonra yerçekimi ile tüpün dibine yerleşmesine izin verildi. Mümkün olduğunca fazla süpernatant çıkarıldıktan sonra, hayvan süspansiyonu, 18 ° C’lik bir RT’de tutulan bir kemotaksis tahlil plakasının orta dairesinde tespit edildi ve daha sonra hayvanların 18 ° C’lik bir RT’de 10 dakika boyunca plaka üzerinde serbestçe hareket etmelerine izin verildi. C.I. değerleri Şekil 3B’de gösterilen denklem kullanılarak hesaplanmıştır. Şekil 4A’da gösterildiği gibi, %1 1-propanol ve HCl karışımı ile şartlandırılmış hayvanlar artık kemotaksis testi için agar plakalarında lekelenen %5 1-propanol’a çekilmezken, naif ve referans hayvanlar benzer şekilde %5 1-propanol’a çekilmiştir. Toplu eğitimden sonra (adım 3.), hafıza artık 3 saat20 içinde gözlenmedi. Dahası, kitlesel eğitimin oluşturduğu hafıza, soğuk şok20’ye duyarlıydı. Bu sonuçlar, C. elegans’ın kitlesel eğitim yoluyla başarılı bir şekilde önleyici STM oluşturduğunu göstermektedir. Hayvanlar ayrıca, eğitim adımları arasında 10 dakikalık bir ITI ile 10x aralıklı eğitim ile şartlandırıldı (adım 4.). ITI sırasında, hayvanlarla toplayıcı, 18 ° C’lik bir RT’de 6 cm’lik bir NGM plakası üzerindeki bakteriyel bir çim üzerine yerleştirildi. % 1 sulu 1-propanol ve HCl (pH 4.0) karışımı ile aralıklı eğitim ile şartlandırılan hayvanlar, sadece% 1-propanol, yalnızca HCl (pH 4.0) veya yalnızca ddH2O (Şekil 4B) ile muamele edilen hayvanlara kıyasla% 5 1-propanol’a çekilmemiştir. Aralıklı eğitimden sonra, hayvanlar hafızayı 12 saat 20,21’den fazla tuttular. Dahası, hayvanlar translasyon veya transkripsiyon inhibitörleri ile tedavi edildiğinde hafıza oluşmadı ve soğuk şoka dirençli20,21. Bu nedenle, C. elegans, aralıklı eğitim ile başarılı bir şekilde aversif LTM’yi oluşturdu. Ayrıca “öğrenme ve hafıza genleri” ndeki mutasyonların STM ve LTM oluşumu üzerindeki etkilerini de inceledik. Crh-1 geni, her yerde bulunan transkripsiyon faktörü cAMP-yanıt elemanı bağlayıcı proteini (CREB), glr-1 ve nmr-1, α-amino-3-hidroksil-5-metil-4-izoksazolepropiyonik asit (AMPA) tipi ve N-metil-D-aspartat (NMDA) tipi glutamat reseptör alt birimlerini kodlar ve stau-1, çift sarmallı RNA bağlayıcı protein Staufen izoformunu kodlar. Bu genler C. elegans, Drosophila, Aplysia ve farelerde klasik koşullanmada önemli roller oynar. % 1 sulu 1-propanol ve HCl (pH 4.0) karışımı kullanılarak, STM ve LTM oluşumu tüm genlere bağlıydı (Şekil 5A, B). Şekil 1: Toplu eğitimin deneysel şeması. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 2: Aralıklı eğitimin deneysel şeması. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 3: Kemotaksi testi ve kemotaksis indeksi. (A) Bir kemotaksis tahlil plakasının şematik gösterimi. Petri çanakları (çapı 6 cm) gösterildiği gibi dört alana ayrıldı ve her biri% 5 sulu 1-propanol veya ddH 2 O’nun her biri 4 μL, merkezden2cm uzakta iki yerde çapraz olarak tespit edildi. (B) Kemotaksi indeks değerleri, kemotaksisin tamamlanmasından sonra “a” ve “b” alanlarındaki hayvan sayısının sayılmasıyla gösterilen denklemden hesaplanmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 4: Kimyasallarla şartlandırılmış hayvanların Kemotaksi indeks değerleri. Senkronize vahşi tip N2 hayvanları, (A) kitlesel eğitim 10x veya (B) aralıklı eğitim 10x ile belirtilen kimyasallarla şartlandırıldı. Kullanılan kütleli ve aralıklı eğitim protokollerinin akış şemaları sırasıyla Şekil 1 ve Şekil 2’de gösterilmiştir. Koşullandırmadan sonra, hayvanlar 18 ° C’lik bir RT’de kemotaksis testi için 6 cm’lik bir agar plakası üzerinde 10 dakika boyunca hareket etmekte özgürdüler. C.I. değerleri Şekil 3B’de gösterilen denklem kullanılarak hesaplanmıştır. Bu şekle ilişkin veriler Ek Tablo 1’de verilmiştir. Naif hayvanlardan elde edilen veriler her iki şekil panelinde de yeniden çizildi. Çubuk grafiği 1. çeyrek, medyan ve 3. çeyreği gösterir. Yıldız işaretleri (*P < 0.05), tek yönlü ANOVA ve ardından Dunnett'in çoklu karşılaştırma testi ile belirlenen istatistiksel olarak anlamlı farklılıkları gösterir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 5: Şartlandırılmış mutant hayvanların indeks değerlerini öğrenmek. Belirtilen senkronize vahşi tip N2 ve mutant hayvanlar, (A) kütleli eğitim 10x veya (B) aralıklı eğitim 10x ile% 1 sulu 1-propanol ve HCl (pH 4.0) karışımı ile şartlandırılmıştır. Kullanılan kütleli ve aralıklı eğitim protokollerinin akış şemaları sırasıyla Şekil 1 ve Şekil 2’de gösterilmiştir. Koşullandırmadan sonra, hayvanlar 18 ° C’lik bir RT’de kemotaksis testi için 6 cm’lik bir agar plakası üzerinde 10 dakika boyunca hareket etmekte özgürdüler. Bu şekle ilişkin veriler Ek Tablo 2’de verilmiştir. Çubuk grafiği 1. çeyrek, medyan ve 3. çeyreği gösterir. Yıldız işaretleri (* P < 0.05), tek yönlü ANOVA ve ardından Dunnett'in çoklu karşılaştırma testi tarafından belirlenen istatistiksel olarak anlamlı farklılıkları gösterir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Ek Şekil 1: Genç yetişkin hayvanlar kimyasal işleme karşı hassastır. Yumurtadan çıktıktan sonra 4. gün ve 5. gün vahşi tip N2 hayvanları, HCl, pH 4.0 ile kesintisiz olarak 10x kitlesel olarak eğitildi ve daha sonra% 5 sulu 1-propanol için kemotaksis için test edildi. Çubuklar, S.E.M. (n = 19) ± anlamına gelir. Yıldız işaretleri (* P < 0.05), iki yönlü ANOVA ve ardından Tukey-Kramer post-hoc testi ile belirlenen istatistiksel olarak anlamlı farklılıkları gösterir. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız. Ek Tablo 1: Şekil 4’e karşılık gelen veriler. Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız. Ek Tablo 2: Şekil 5’e karşılık gelen veriler. Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Discussion

Bu çalışmada, tüm reaktifler ortalama olarak ~ 18 ° C’lik bir RT’de tutuldu ve hayvanlara stresi önlemek için RT’deki bir bankta hayvanlar yetiştirildi. Hayvanlar başlangıçta 20 ° C’de bir inkübatörde yetiştirildi ve daha sonra RT’deki reaktifler kullanılarak ~ 24 ° C’de bir tezgahta şartlandırıldı. Bu koşullar altında, koşullanmanın sonuçları çok değişkendi. Düşük RT’de, C. elegans yavaş büyür ve hayvanlar olgun yetişkinlik aşamasına ulaşana kadar 20 ° C’den daha uzun süre yetiştirilmelidir, çünkü genç yetişkin hayvanlar şartlandırma için kullanılan kimyasallara olgun yetişkin hayvanlardan daha duyarlıdır ve daha düşük CIA değerleri gösterebilir.

Başarılı bir koşullandırma için en kritik adım, her kimyasal işlemden hemen sonra hayvanların ddH2O ile yıkanmasıdır. Bu nedenle, kesilmiş pipet uçları kullanılarak, reaktifleri RT’de tutarak ve hayvan toplayıcısını ddH2O’da çok yavaş bir şekilde yukarı ve aşağı hareket ettirerek hayvanları çok nazikçe yıkayarak mekanik ve sıcaklık gerilimleri en aza indirilmelidir. Kemotaksis tahlil plakalarının koşulları da sonuçları ciddi şekilde etkiler. Çok kuru veya çok ıslak plakalar, hayvanların düzgün hareket etmesini önler. Plakalar adım 1’de açıklandığı gibi hazırlanmıştır.; İyi bir plaka, ddH2O veya% 5 sulu 1-propanol’un 4 μL lekelerinin, lekelenmeden yaklaşık 5 dakika sonra agar tarafından tamamen emildiği bir plakadır. Yukarıda tarif edildiği gibi, hayvan yaşları da başarılı koşullandırma için kritik öneme sahiptir. Genç yetişkin hayvanlar mekanik ve kimyasal işlemlere karşı hassastır, bu da değişken sonuçlara neden olur, ancak çok yaşlı hayvanlar da şartlandırma için uygun olmayabilir.

1-propanolün raf ömrü markalara ve lotlara bağlıdır ve RT’de 3 aydan azdır. Naif hayvanların CIA değerleri kötüleştiğinde, şartlandırma ve kemotaksis testi için taze 1-propanol kullanılması tavsiye edilir.

Kitlesel eğitim ile hafıza oluşumu, translasyon inhibitörleri (sikloheksimid ve anizomisin) ve bir transkripsiyon inhibitörü (aktinomisin D) ile hayvanların tedavisinden etkilenmezken, aralıklı eğitim ile hafıza oluşumu inhibitörler20,21 tarafından belirgin bir şekilde inhibe edildi. Dahası, eski hafıza soğuk şokla çürürken, ikincisi birincisinden daha uzun süre tutuldu ve soğuk şoka karşı dirençliydi. Bu sonuçlar, birincisinin STM ve ikincisinin LTM olduğunu, sırasıyla20,21 olduğunu göstermektedir. Bununla birlikte, kitlesel eğitimin oluşturduğu bellek, STM ve orta vadeli (orta vadeli) bellekten oluşabilir, çünkü STM, CREB transkripsiyon faktörüne zayıf bir şekilde bağımlıdır (Şekil 5A). Bu, STM’nin 1 saat20,21’den fazla tutulduğu sonucuyla tutarlıdır. Hem STM hem de LTM’nin oluşumu, C. elegans27,28’de sadece altı çift nöronda (AVA, AVD, AVE, RIM, AVG ve PVC) ifade edilen nmr-1’e büyük ölçüde bağımlıdır. Bu nedenle, bu nöronlarda, NMDA reseptörleri, sinaptik plastisite için% 1 sulu 1-propanol ve HCl (pH 4.0) sinyallerinin moleküler bir tesadüf dedektörü olarak işlev görebilir; burada hem STM hem de LTM için gerekli olan sinaptik güçlendirme, sinaptik nöronların 29,30,31,32,33 öncesi ve sonrası tesadüfen ateşlenmesinden kaynaklanabilir. Bu nedenle, internöronlar arasında aversif ilişkisel hafıza oluşabilir.

Bu çalışmada açıklanan yöntemler, iştah açıcı koku alma ve CS olarak 1-nonanol ve US21 olarak potasyum klorür kullanılarak kısa süreli ve uzun süreli ilişkisel hafıza için uygulanabilir olmalıdır. İştah açıcı ve engelleyici anıların oluşumunda rol oynayan nöronal devreleri karşılaştırmak ilginçtir.

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Takashi Murayama, Ei-ichiro Saita, Iou Ven Chang ve Hitomi Ohtaki’ye teknik yardımları ve el yazması hakkındaki yorumları için minnettarız. Suşlar, NIH Ulusal Araştırma Kaynakları Merkezi (NCRR) tarafından finanse edilen Caenorhabditis Genetik Merkezi tarafından sağlanmıştır. Bu çalışma, Okinawa Bilim ve Teknoloji Enstitüsü Yüksek Lisans Üniversitesi’nin finansmanıyla desteklendi.

Materials

500 mL beaker HARIO B-500-H32
10 µL pipette tips Thermo Fisher Scientific H-104-96RS-Q
0.2 mL pipette tips Thermo Fisher Scientific TTW110RS-Q
1.0 mL pipette tips Thermo Fisher Scientific H-111-R100NS-Q
1.5 mL plastic tubes Eppendorf 0030120086
2 mL plastic tubes Eppendorf 0030120094
10 mL Serological pipettes As One 2-5237-04
50 mL Serological pipettes As One 2-5237-06
6-well cell culture plate Costar 3516
Aron Alpha (Glue for plastic) Toagosei High Speed EX
Autoclave Tomy Digital Biology SX-300
Bacto agar BD 214010
Bacto peptone BD 211677
Bottle top 0.2 µm filter units Thermo Fisher Scientific 566-0020
Bunsen burner EISCO SKU CH0089A
Calcium chloride dihydrate Nacalai Tesque 06730-15
C. elegans mutant strains Caenorhabditis Genetics Center
Cholesterol Wako Pure Chemical Industries 034-03002
Clear acrylic cylindrical pipe Asahi Kasei 3.5 cm (length), 30 mm (external diameter), 2 mm (thickness)
Crystallizing dish Pyrex 3140-80
Dental burner Phoenix-Dent APT-3
Di-potassium hydrogen phosphate Nacalai Tesque 28726-05
E. coli OP50 Caenorhabditis Genetics Center
Electric pipetter Drummond Scientific 4-000-101
Gelatin Wako Pure Chemical Industries 073-06295
Glass Petri dishes (10 cm in diameter) As One  Trade FLAT Mark
Heating magnetic stirrer Thermo Fisher Scientific SP131324
Hydrochloric acid Nacalai Tesque 37345-15
Incubator SANYO MIR-553
Kimwipes S-200 Nippon Paper Crecia 62011
Laboratory coat TOYO LINT FREE FH240C
Magnesium sulfate heptahydrate Nacalai Tesque 21002-85
Magnetic stirrer bar SANSYO 93-5412
Metal spatula FUJIFILM Wako 647-06531
Nitrile gloves Kimberly-Clark KC100
Nylon mesh (mesh size: 30 μm) SEFAR NY30-HD
P10 pipetman Gilson F144802
P200 pipetman Gilson F123600
P1000 pipetman Gilson F123602
pH meter HORIBA  Navi F-52
Plastic Petri dishes (9 cm in diameter) IWAKI SH90-15E
Plastic Petri dishes (6 cm in diameter) SARSTEDT 82.1194.500
Plastic weighing boats As One 1-5233-01
Platinum wire for a worm pick Nilaco PT-351265
1-Propanol SIGMA-ALDRICH 279544
Potassium dihydrogen phosphate Nacalai Tesque 28721-55
Safety goggles Kimberly-Clark #25646
Sodium chloride Nacalai Tesque 31320-05
Stereomicroscope Olympus SZX16
Tooth picks
Water purification sysytem Merck Elix Essential 10 UV
Water urification sysytem Merck Milli-Q Synthesis A10
Weighing balance METTLER  TOREDO
Wild type C. elegans strain N2 Caenorhabditis Genetics Center
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referenzen

  1. White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 314 (1165), 1 (1986).
  2. Cook, S. J., et al. Whole-animal connectomes of both Caenorhabditis elegans sexes. Nature. 571 (7763), 63-71 (2019).
  3. Witvliet, D., et al. Connectomes across development reveal principles of brain maturation. Nature. 596, 257-261 (2021).
  4. Hedgecock, E. M., Russell, R. L. Normal and mutant thermotaxis in the nematode Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 72 (10), 4061-4065 (1975).
  5. Mohri, A., et al. Genetic control of temperature preference in the nematode Caenorhabditis elegans. Genetik. 169 (3), 1437-1450 (2005).
  6. Wen, J. Y. M., et al. Mutations that prevent associative learning in C. elegans. Behavioral Neuroscience. 111 (2), 354-368 (1997).
  7. Saeki, S., Yamamoto, M., Iino, Y. Plasticity of chemotaxis revealed by paired presentation of a chemoattractant and starvation in the nematode Caenorhabditis elegans. Journal of Experimental Biology. 204 (10), 1757-1764 (2001).
  8. Tomioka, M., et al. The insulin/PI3-kinase pathway regulates salt chemotaxis learning in Caenorhabditis elegans. Neuron. 51 (5), 613-625 (2006).
  9. Torayama, I., Ishihara, T., Katsura, I. Caenorhabditis elegans integrates the signals of butanone and food to enhance chemotaxis to butanone. Journal of Neuroscience. 27 (4), 741-750 (2007).
  10. Kaufman, A. L., Ashraf, J. M., Corces-Zimmerman, M. R., Landis, J. N., Murphy, C. T. Insulin signaling and dietary restriction differentially influence the decline of learning and memory with age. PLoS Biology. 8 (5), 1000372 (2010).
  11. Stein, G. M., Murphy, C. T. C. elegans positive olfactory associative memory is a molecularly conserved behavioral paradigm. Neurobiology of Learning and Memory. 115, 86-94 (2014).
  12. Rahmani, A., Chew, Y. L. Investigating the molecular mechanisms of learning and memory using Caenorhabditis elegans. Journal of Neurochemistry. 159 (3), 417-451 (2021).
  13. Bargmann, C. I. Chemosensation in C. elegans. WormBook. 25, 1-29 (2006).
  14. Gray, J. M., Hill, J. J., Bargmann, C. I. A circuit for navigation in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (9), 3184-3191 (2005).
  15. Cho, C. E., Brueggemann, C., L’Etoile, N. D., Bargmann, C. I. Parallel encoding of sensory history and behavioral preference during Caenorhabditis elegans olfactory learning. eLife. 5, 14000 (2016).
  16. Juang, B. T., et al. Endogenous nuclear RNAi mediates behavioral adaptation to odor. Cell. 154 (5), 1010-1022 (2013).
  17. Neal, S. J., et al. Feeding state-dependent regulation of developmental plasticity via CaMKI and neuroendocrine signaling. eLife. 4, 10110 (2015).
  18. Castellucci, V. F., Kandel, E. R. A quantal analysis of the synaptic depression underlying habituation of the gill-withdrawal reflex in Aplysia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 71 (12), 5004-5008 (1974).
  19. Klein, M., Kandel, E. R. Mechanism of calcium current modulation underlying presynaptic facilitation and behavioral sensitization in Aplysia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 77 (11), 6912-6916 (1980).
  20. Amano, H., Maruyama, I. N. Aversive olfactory learning and associative long-term memory in Caenorhabditis elegans. Learning & Memory. 18 (10), 654-665 (2011).
  21. Nishijima, S., Maruyama, I. N. Appetitive olfactory learning and long-term associative memory in Caenorhabditis elegans. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 11, 80 (2017).
  22. Morrison, G. E., Wen, J. Y. M., Runciman, S., vander Kooy, D. Olfactory associative learning in Caenorhabditis elegans is impaired in lrn-1 and lrn-2 mutants. Behavioral Neuroscience. 113 (2), 358-367 (1999).
  23. Morrison, G. E., vander Kooy, D. A mutation in the AMPA-type glutamate receptor, glr-1, blocks olfactory associative and nonassociative learning in Caenorhabditis elegans. Behavioral Neuroscience. 115 (3), 640-649 (2001).
  24. Bargmann, C. I., Hartwieg, E., Horvitz, H. R. Odorant-selective genes and neurons mediate olfaction in C. elegans. Cell. 74 (3), 515-527 (1993).
  25. Sambongi, Y., et al. Caenorhabditis elegans senses protons through amphid chemosensory neurons: Proton signals elicit avoidance behavior. Neuroreport. 11 (10), 2229-2232 (2000).
  26. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetik. 77 (1), 71-94 (1974).
  27. Brockie, P. J., Madsen, D. M., Zheng, Y., Mellem, J., Maricq, A. V. Differential expression of glutamate receptor subunits in the nervous system of Caenorhabditis elegans and their regulation by the homeodomain protein UNC-42. Journal of Neuroscience. 21 (5), 1510-1522 (2001).
  28. Brockie, P. J., Mellem, J. E., Hills, T., Madsen, D. M., Maricq, A. V. The C. elegans glutamate receptor subunit NMR-1 is required for slow NMDA-activated currents that regulate reversal frequency during locomotion. Neuron. 31 (4), 617-630 (2001).
  29. Gustafsson, B., Wingstrom, H. Physiological mechanisms underlying long-term potentiation. Trends in Neuroscience. 11 (4), 156-162 (1988).
  30. Kauer, J. A., Malenka, R. C., Nicoll, R. A. A persistent postsynaptic modification mediates long-term potentiation in the hippocampus. Neuron. 1 (10), 911-917 (1988).
  31. Bliss, T. V. P., Collingridge, G. L. A synaptic model of memory: Long-term potentiation in the hippocampus. Nature. 361 (6407), 31-39 (1993).
  32. Bailey, C. H., Giustetto, M., Huang, Y. Y., Hawkins, R. D., Kandel, E. R. Is heterosynaptic modulation essential for stabilizing Hebbian plasticity and memory. Nature Reviews Neuroscience. 1 (1), 11-20 (2000).
  33. Miyashita, T., et al. Mg2+ block of Drosophila NMDA receptors is required for long-term memory formation and CREB-dependent gene expression. Neuron. 74 (5), 887-898 (2012).

Tags

Caenorhabditis ElegansLearningMemoryAversive Associative LearningChemical PairingNervous SystemBehavioral AnalysisNematode Growth MediumE. Coli OP50Gravid AnimalsAnimal Collector1-propanolHydrochloric AcidChemotaxis Assay

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Diesen Artikel zitieren
Shibutani, M., Vibulyaseck, S., Maruyama, I. N. Aversive Associative Learning and Memory Formation by Pairing Two Chemicals in Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (184), e64137, doi:10.3791/64137 (2022).
Zitat herunterladen
Nachdrucke und Berechtigungen

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image