Purification biochimique et caractérisation protéomique des noyaux de fibrilles amyloïdes du cerveau
Summary
Cette méthode de purification biochimique avec analyse protéomique basée sur la spectrométrie de masse facilite la caractérisation robuste des noyaux de fibrilles amyloïdes, ce qui peut accélérer l’identification de cibles pour la prévention de la maladie d’Alzheimer.
Abstract
Les inclusions fibrillaires protéiques sont des caractéristiques pathologiques clés de multiples maladies neurodégénératives. Dans les premiers stades de la maladie d’Alzheimer (MA), les peptides bêta-amyloïdes forment des protofibrilles dans l’espace extracellulaire, qui agissent comme des graines qui se développent progressivement et mûrissent en grandes plaques amyloïdes. Malgré cette compréhension de base, les connaissances actuelles sur la structure, la composition et les modèles de dépôt des fibrilles amyloïdes dans le cerveau sont limitées. Une barrière majeure a été l’incapacité d’isoler les fibrilles amyloïdes hautement purifiées des extraits de cerveau. Des approches basées sur la purification par affinité et la capture laser par microdissection ont déjà été utilisées pour isoler les amyloïdes, mais sont limitées par la petite quantité de matériau qui peut être récupérée. Ce nouveau protocole robuste décrit la purification biochimique des noyaux de plaque amyloïde à l’aide de la solubilisation au dodécylsulfate de sodium (SDS) avec ultracentrifugation et ultrasons du gradient de densité de saccharose et donne des fibrilles très pures de patients atteints de MA et de tissus cérébraux modèles de DA. L’analyse protéomique ascendante basée sur la spectrométrie de masse (SEP) du matériau purifié représente une stratégie robuste pour identifier presque tous les composants protéiques primaires des fibrilles amyloïdes. Des études protéomiques antérieures sur les protéines de la couronne amyloïde ont révélé une collection de protéines étonnamment grande et fonctionnellement diversifiée. Notamment, après avoir affiné la stratégie de purification, le nombre de protéines co-purifiantes a été réduit de plus de 10 fois, ce qui indique la grande pureté du matériau insoluble isolé SDS. La coloration négative et la microscopie électronique immuno-or ont permis de confirmer la pureté de ces préparations. D’autres études sont nécessaires pour comprendre les attributs spatiaux et biologiques qui contribuent au dépôt de ces protéines dans les inclusions amyloïdes. Dans l’ensemble, cette stratégie analytique est bien positionnée pour améliorer la compréhension de la biologie amyloïde.
Introduction
L’amyloïde est un arrangement supramoléculaire extrêmement stable que l’on trouve dans un panel diversifié de protéines, dont certaines conduisent à des changements pathologiques1. L’accumulation d’agrégats amyloïdes intra- ou extracellulaires est observée dans plusieurs maladies neurodégénératives2. Les agrégats amyloïdes sont hétérogènes et sont enrichis d’un grand nombre de protéines et de lipides3. Au cours des dernières années, l’intérêt pour le protéome amyloïde a suscité un intérêt considérable parmi les neuroscientifiques de base et translationnels. Plusieurs méthodes ont été mises au point pour extraire et purifier les agrégats amyloïdes des tissus cérébraux humains de souris et post-mortem. La microdissection par capture laser, l’immunoprécipitation, la décellularisation et l’isolement biochimique des agrégats amyloïdes sont des méthodes largement utilisées pour extraire et purifier les plaques amyloïdes, les fibrilles et les oligomères 4,5,6,7. Beaucoup de ces études se sont concentrées sur la détermination de la composition protéique de ces dépôts fibrillaires étroitement emballés à l’aide de la SEP semi-quantitative. Cependant, les résultats disponibles sont incohérents et le nombre étonnamment élevé de protéines co-purifiantes précédemment rapportées est difficile à interpréter.
La principale limite de la littérature existante décrivant le protéome du noyau amyloïde dans les cerveaux modèles murins AD et AD est que le matériel purifié contient un nombre ingérable de protéines co-purifiantes. L’objectif global de cette méthode est de surmonter cette limitation et de développer une purification biochimique robuste pour isoler les noyaux de fibrilles amyloïdes. Cette stratégie utilise une méthode biochimique basée sur l’ultracentrifugation du gradient de densité de saccharose décrite précédemment pour isoler les fractions amyloïdes enrichies insolubles dans le SDS à partir de tissus cérébraux humains et murins post-mortemAD 8,9. Cette méthode s’appuie sur la littérature existante, mais va plus loin avec les ultrasons et les lavages SDS pour éliminer la plupart des protéines associées à l’amyloïde faiblement liées, conduisant à l’isolement des fibrilles amyloïdes hautement purifiées (Figure 1). Les fibrilles purifiées par ce protocole surmontent plusieurs défis existants fréquemment rencontrés dans les études structurelles de fibrilles amyloïdes isolées à partir d’extraits cérébraux. La visualisation de ces fibrilles par microscopie électronique à transmission (TEM) confirme l’intégrité et la pureté du matériau purifié (Figure 2). Dans cette étude, les fibrilles isolées sont solubilisées et digérées en peptides avec de la trypsine, et l’analyse de la SEP sans étiquette peut facilement révéler l’identité des protéines formant le noyau de la fibrilure. Notamment, certaines de ces protéines ont une tendance inhérente à former des assemblages supramoléculaires dans des organites non liés à la membrane. En outre, de nombreuses protéines identifiées dans l’analyse des fibrilles bêta-amyloïdes (Aβ) sont également associées à d’autres maladies neurodégénératives, ce qui suggère que ces protéines peuvent jouer un rôle clé dans de multiples protéinopathies.
Il est peu probable que cette méthode de FDS/ultrasons modifie ou perturbe la structure des noyaux de fibrilles. Le matériau purifié convient également à un large éventail d’approches d’analyse protéomique descendante et ascendante et à d’autres stratégies d’analyse structurelle basées sur la SEP, telles que la réticulation chimique ou l’échange hydrogène-deutérium. La récupération globale à l’aide de cette méthode est relativement élevée et convient donc aux études structurelles détaillées, qui nécessitent des microgrammes à des milligrammes du matériau purifié. Le matériau purifié convient également aux études structurelles utilisant cryoEM et la microscopie à force atomique. Ce protocole, combiné au marquage isotopique stable des mammifères, peut faciliter les études par résonance magnétique nucléaire (RMN) à l’état solide de la structure amyloïde10.
Protocol
Representative Results
Discussion
Développer une compréhension claire de la structure et de la composition amyloïdes est difficile pour les biologistes structuraux et les biochimistes en raison des complexités biologiques et des limites expérimentales dans l’extraction des fibrilles purifiées des tissus cérébraux de laMA 16,17. Les fibrilles amyloïdes sont polymorphes au niveau moléculaire, montrant une population hétérogène de longueurs et de complexités variables<sup class="xref…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par la subvention niH R01AG061865 à R.J.V. et J.N.S. Les auteurs remercient les membres du groupe de recherche Vassar et Savas de l’Université Northwestern pour leurs discussions réfléchies. Nous remercions également sincèrement dr(s). Ansgar Seimer et Ralf Langen de l’Université de Californie du Sud pour leur contribution cruciale. Nous remercions le Dr Farida Korabova pour la préparation des échantillons et l’imagerie par microscopie électronique à coloration négative au Northwestern University Center for Advanced Microscopy.
Materials
| Acclaim PepMap 100 C18 HPLC column 0.075 mm x 20 mm | Thermo Scientific | 164535 | Alternative instruments, chemicals and antibodies from other manufacturers can be used |
| Ammonium bicarbonate | Sigma-Aldrich | 9830 | |
| anti-amyloid beta (1-16) 6E10 antibody | Biolegend | 803001 | |
| anti-amyloid beta (17-24) 4G8 antibody | Biolegend | 800701 | |
| anti-amyloid beta (N terminus 82E1) antibody | IBL America | 10323 | |
| anti-amyloid fibril LOC antibody | EMD Millipore | AB2287 | |
| BCA kit | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| Bioruptor Pico Plus | Diagenode | B01020001 | |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| Collagenase | Sigma-Aldrich | C0130 | |
| Complete Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | 11697498001 | |
| Dnase I | Thermo Fisher Scientific | EN0521 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | EDS | |
| Guanidine hydrochloride | Sigma-Aldrich | G4505 | |
| HyperSep C18 Cartridges | Thermo Fisher Scientific | 60108-302 | |
| Integrated Proteomics Pipeline – IP2 | http://www.integratedproteomics.com/ | ||
| Iodoacetamide (IAA) | Sigma-Aldrich | I1149 | |
| K54 Tissue Homogenizing System Motor | Cole Parmer | Glas-Col 099C | |
| MaxQuant | https://www.maxquant.org/ | ||
| Micro BCA kit | Thermo Fisher Scientific | 23235 | |
| Nanoviper 75 μm x 50 cm | Thermo Scientific | 164942 | |
| Optima L-90K Ultracentrifuge | Beckman Coulter | BR-8101P-E | |
| Orbitrap Fusion TribridMass Spectrometer | Thermo Scientific | IQLAAEGAAPFADBMBCX | |
| Pierce C18 Spin Columns | Thermo Fisher Scientific | 89870 | |
| Precellys 24 tissue homogenizer | Bertin Instruments | P000062-PEVO0-A | |
| ProteaseMAX(TM) Surfactant Trypsin Enhancer | Promega | V2072 | |
| RawConverter | http://www.fields.scripps.edu/rawconv/ | ||
| Sodium azide | VWR | 97064-646 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | 74255 | |
| Sorvall Legend Micro 21R Microcentrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75002446 | |
| Speed Vaccum Concentrator | Labconco | 7315021 | |
| Tris-2-carboxyethylphosphine (TCEP) | Sigma-Aldrich | C4706-2G | |
| Tris-HCl | Thermo Fisher Scientific | 15568025 | |
| Trypsin Gold-Mass spec grade | Promega | V5280 | |
| UltiMate 3000 RSLCnano System | Thermo Scientific | ULTIM3000RSLCNANO |
Referenzen
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