Purificazione biochimica e caratterizzazione proteomica dei nuclei di fibrille amiloidi dal cervello
Summary
Questo metodo di purificazione biochimica con analisi proteomica basata sulla spettrometria di massa facilita la robusta caratterizzazione dei nuclei di fibrille amiloidi, che possono accelerare l’identificazione di bersagli per la prevenzione della malattia di Alzheimer.
Abstract
Le inclusioni fibrillari proteiche sono caratteristiche patologiche chiave di più malattie neurodegenerative. Nelle prime fasi della malattia di Alzheimer (AD), i peptidi amiloide-beta formano protofibrille nello spazio extracellulare, che agiscono come semi che gradualmente crescono e maturano in grandi placche amiloidi. Nonostante questa comprensione di base, l’attuale conoscenza della struttura, della composizione e dei modelli di deposizione delle fibrille amiloidi nel cervello è limitata. Uno dei principali ostacoli è stata l’incapacità di isolare fibrille amiloidi altamente purificate dagli estratti cerebrali. Gli approcci basati sulla purificazione dell’affinità e sulla microdissezione di cattura laser sono stati precedentemente utilizzati per isolare le amiloidi, ma sono limitati dalla piccola quantità di materiale che può essere recuperato. Questo nuovo e robusto protocollo descrive la purificazione biochimica dei nuclei della placca amiloide utilizzando la solubilizzazione del dodecil solfato di sodio (SDS) con ultracentrifugazione e ultrasuoni del gradiente di densità di saccarosio e produce fibrille altamente pure da pazienti CON AD e tessuti cerebrali modello AD. L’analisi proteomica bottom-up basata sulla spettrometria di massa (MS) del materiale purificato rappresenta una solida strategia per identificare quasi tutti i componenti proteici primari delle fibrille amiloidi. Precedenti studi proteomici sulle proteine nelle coronae amiloidi hanno rivelato una collezione di proteine inaspettatamente ampia e funzionalmente diversificata. In particolare, dopo aver perfezionato la strategia di purificazione, il numero di proteine co-purificanti è stato ridotto di oltre 10 volte, indicando l’elevata purezza del materiale insolubile SDS isolato. La colorazione negativa e la microscopia elettronica immuno-oro hanno permesso di confermare la purezza di questi preparati. Sono necessari ulteriori studi per comprendere gli attributi spaziali e biologici che contribuiscono alla deposizione di queste proteine in inclusioni amiloidi. Nel complesso, questa strategia analitica è ben posizionata per aumentare la comprensione della biologia amiloide.
Introduction
L’amiloide è una disposizione supramolecolare estremamente stabile che si trova in un gruppo diversificato di proteine, alcune delle quali portano a cambiamenti patologici1. L’accumulo di aggregati amiloidi intra- o extracellulari è osservato in diverse malattie neurodegenerative2. Gli aggregati amiloidi sono eterogenei e sono arricchiti con un gran numero di proteine e lipidi3. Negli ultimi anni, l’interesse per il proteoma amiloide ha generato un notevole interesse tra i neuroscienziati di base e traslazionali. Sono stati sviluppati diversi metodi per estrarre e purificare gli aggregati amiloidi dai tessuti cerebrali umani di topo e post-mortem. La microdissezione a cattura laser, l’immunoprecipitazione, la decellularizzazione e l’isolamento biochimico degli aggregati amiloidi sono metodi ampiamente utilizzati per estrarre e purificare placche amiloidi, fibrille e oligomeri 4,5,6,7. Molti di questi studi si sono concentrati sulla determinazione della composizione proteica di questi depositi fibrillari strettamente imballati utilizzando la SM semi-quantitativa. Tuttavia, i risultati disponibili sono incoerenti e il numero sorprendentemente elevato di proteine co-purificanti precedentemente riportate sono difficili da interpretare.
La limitazione principale della letteratura esistente che descrive il proteoma del nucleo amiloide nei cervelli modello murino AD e AD è che il materiale purificato contiene un numero ingestibile di proteine co-purificanti. L’obiettivo generale di questo metodo è quello di superare questa limitazione e sviluppare una robusta purificazione biochimica per isolare i nuclei delle fibrille amiloidi. Questa strategia impiega un metodo biochimico basato sull’ultracentrifugazione del gradiente di densità di densità del saccarosio precedentemente descritto per l’isolamento di frazioni amiloidi arricchite insolubili SDS da tessuti cerebrali umani e murini post-mortem AD 8,9. Questo metodo si basa sulla letteratura esistente, ma va oltre con l’ultrasonicazione e i lavaggi SDS per rimuovere la maggior parte delle proteine associate all’amiloide liberamente legate, portando all’isolamento di fibrille amiloidi altamente purificate (Figura 1). Le fibrille purificate da questo protocollo superano diverse sfide esistenti frequentemente incontrate negli studi strutturali delle fibrille amiloidi isolate dagli estratti cerebrali. La visualizzazione di queste fibrille con microscopia elettronica a trasmissione (TEM) conferma l’integrità e la purezza del materiale purificato (Figura 2). In questo studio, le fibrille isolate vengono solubilizzate e digerite in peptidi con tripsina e l’analisi della SM senza etichetta può facilmente rivelare l’identità delle proteine che formano il nucleo della fibrilla. In particolare, alcune di queste proteine hanno una tendenza intrinseca a formare assemblaggi supramolecolari in organelli non legati alla membrana. Inoltre, molte delle proteine identificate nell’analisi delle fibrille amiloide-beta (Aβ) sono anche associate ad altre malattie neurodegenerative, suggerendo che queste proteine possono svolgere un ruolo chiave in più proteinopatie.
È improbabile che questo metodo SDS / ultrasuoni alteri o interrompa la struttura dei nuclei delle fibrille. Il materiale purificato è adatto anche per una vasta gamma di approcci di analisi proteomica top-down e bottom-up e ulteriori strategie di analisi strutturale basate su MS, come la reticolazione chimica o lo scambio idrogeno-deuterio. Il recupero complessivo utilizzando questo metodo è relativamente elevato e, quindi, è adatto per studi strutturali dettagliati, che richiedono microgrammi a milligrammi del materiale purificato. Il materiale purificato è adatto anche per studi strutturali utilizzando crioEM e microscopia a forza atomica. Questo protocollo, in combinazione con l’etichettatura isotopica stabile dei mammiferi, può facilitare gli studi di risonanza magnetica nucleare allo stato solido (NMR) della struttura amiloide10.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sviluppare una chiara comprensione della struttura e della composizione dell’amiloide è difficile per i biologi strutturali e i biochimici a causa delle complessità biologiche e delle limitazioni sperimentali nell’estrazione di fibrille purificate dai tessuti cerebrali dell’AD16,17. Le fibrille amiloidi sono polimorfiche a livello molecolare, mostrando una popolazione eterogenea di varie lunghezze e complessità18,19<sup class…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato dalla sovvenzione NIH R01AG061865 a R.J.V. e J.N.S. Gli autori ringraziano i membri del gruppo di ricerca Vassar e Savas della Northwestern University per le loro discussioni ponderate. Ringraziamo sinceramente anche i dottori. Ansgar Seimer e Ralf Langen della University of South California per il loro contributo cruciale. Ringraziamo la dott.ssa Farida Korabova per la preparazione del campione e l’imaging al microscopio elettronico con colorazione negativa presso il Northwestern University Center for Advanced Microscopy.
Materials
| Acclaim PepMap 100 C18 HPLC column 0.075 mm x 20 mm | Thermo Scientific | 164535 | Alternative instruments, chemicals and antibodies from other manufacturers can be used |
| Ammonium bicarbonate | Sigma-Aldrich | 9830 | |
| anti-amyloid beta (1-16) 6E10 antibody | Biolegend | 803001 | |
| anti-amyloid beta (17-24) 4G8 antibody | Biolegend | 800701 | |
| anti-amyloid beta (N terminus 82E1) antibody | IBL America | 10323 | |
| anti-amyloid fibril LOC antibody | EMD Millipore | AB2287 | |
| BCA kit | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| Bioruptor Pico Plus | Diagenode | B01020001 | |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| Collagenase | Sigma-Aldrich | C0130 | |
| Complete Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | 11697498001 | |
| Dnase I | Thermo Fisher Scientific | EN0521 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | EDS | |
| Guanidine hydrochloride | Sigma-Aldrich | G4505 | |
| HyperSep C18 Cartridges | Thermo Fisher Scientific | 60108-302 | |
| Integrated Proteomics Pipeline – IP2 | http://www.integratedproteomics.com/ | ||
| Iodoacetamide (IAA) | Sigma-Aldrich | I1149 | |
| K54 Tissue Homogenizing System Motor | Cole Parmer | Glas-Col 099C | |
| MaxQuant | https://www.maxquant.org/ | ||
| Micro BCA kit | Thermo Fisher Scientific | 23235 | |
| Nanoviper 75 μm x 50 cm | Thermo Scientific | 164942 | |
| Optima L-90K Ultracentrifuge | Beckman Coulter | BR-8101P-E | |
| Orbitrap Fusion TribridMass Spectrometer | Thermo Scientific | IQLAAEGAAPFADBMBCX | |
| Pierce C18 Spin Columns | Thermo Fisher Scientific | 89870 | |
| Precellys 24 tissue homogenizer | Bertin Instruments | P000062-PEVO0-A | |
| ProteaseMAX(TM) Surfactant Trypsin Enhancer | Promega | V2072 | |
| RawConverter | http://www.fields.scripps.edu/rawconv/ | ||
| Sodium azide | VWR | 97064-646 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | 74255 | |
| Sorvall Legend Micro 21R Microcentrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75002446 | |
| Speed Vaccum Concentrator | Labconco | 7315021 | |
| Tris-2-carboxyethylphosphine (TCEP) | Sigma-Aldrich | C4706-2G | |
| Tris-HCl | Thermo Fisher Scientific | 15568025 | |
| Trypsin Gold-Mass spec grade | Promega | V5280 | |
| UltiMate 3000 RSLCnano System | Thermo Scientific | ULTIM3000RSLCNANO |
Referenzen
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