التنقية البيوكيميائية والتوصيف البروتيني للنوى الليفية الأميلويد من الدماغ
Summary
تسهل طريقة التنقية البيوكيميائية هذه مع التحليل البروتيني القائم على قياس الطيف الكتلي التوصيف القوي لنوى ألياف الأميلويد ، مما قد يسرع من تحديد الأهداف للوقاية من مرض الزهايمر.
Abstract
شوائب الألياف البروتينية هي السمات المميزة المرضية الرئيسية للأمراض العصبية التنكسية المتعددة. في المراحل المبكرة من مرض الزهايمر (AD) ، تشكل ببتيدات أميلويد بيتا بدائيات في الفضاء خارج الخلية ، والتي تعمل كبذور تنمو تدريجيا وتنضج إلى لويحات أميلويد كبيرة. على الرغم من هذا الفهم الأساسي ، فإن المعرفة الحالية ببنية ألياف الأميلويد وتكوينها وأنماط ترسبها في الدماغ محدودة. كان أحد الحواجز الرئيسية هو عدم القدرة على عزل ألياف الأميلويد عالية النقاء من مستخلصات الدماغ. وقد استخدمت في السابق أساليب تنقية التقارب والتقاط التشريح المجهري بالليزر لعزل الأميلويد ولكنها محدودة بسبب الكمية الصغيرة من المواد التي يمكن استردادها. يصف هذا البروتوكول الجديد القوي التنقية الكيميائية الحيوية لنوى لوحة الأميلويد باستخدام ذوبان كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS) مع الطرد المركزي بتدرج كثافة السكروز والموجات فوق الصوتية وينتج ألياف عالية النقاء من مرضى AD وأنسجة المخ نموذج AD. يمثل التحليل البروتيني القائم على قياس الطيف الكتلي (MS) للمواد النقية من أسفل إلى أعلى استراتيجية قوية لتحديد جميع مكونات البروتين الأولية تقريبا من ألياف الأميلويد. كشفت الدراسات البروتينية السابقة للبروتينات في إكليل الأميلويد عن مجموعة كبيرة بشكل غير متوقع ومتنوعة وظيفيا من البروتينات. والجدير بالذكر أنه بعد تحسين استراتيجية التنقية ، تم تقليل عدد البروتينات المشاركة في التنقية بأكثر من 10 أضعاف ، مما يشير إلى النقاء العالي للمواد غير القابلة للذوبان SDS المعزولة. سمح التلطيخ السلبي والمجهر الإلكتروني المناعي الذهبي بتأكيد نقاء هذه المستحضرات. هناك حاجة إلى مزيد من الدراسات لفهم السمات المكانية والبيولوجية التي تسهم في ترسب هذه البروتينات إلى شوائب أميلويد. هذه الاستراتيجية التحليلية مجتمعة في وضع جيد لزيادة فهم بيولوجيا الأميلويد.
Introduction
الأميلويد هو ترتيب فوق جزيئي مستقر للغاية يوجد في مجموعة متنوعة من البروتينات ، بعضها يؤدي إلى تغيرات مرضية1. لوحظ تراكم مجاميع الأميلويد داخل أو خارج الخلايا في العديد من الأمراض العصبية التنكسية2. مجاميع الأميلويد غير متجانسة ويتم إثراؤها بعدد كبير من البروتينات والدهون3. في السنوات الأخيرة ، ولد الاهتمام ببروتينات الأميلويد اهتماما كبيرا بين علماء الأعصاب الأساسيين والانتقاليين. تم تطوير العديد من الطرق لاستخراج وتنقية مجاميع الأميلويد من أنسجة المخ البشرية بعد الوفاة والفئران. التشريح المجهري لالتقاط الليزر ، والترسيب المناعي ، وإزالة الخلايا ، والعزل الكيميائي الحيوي لمجاميع الأميلويد هي طرق تستخدم على نطاق واسع لاستخراج وتنقية لويحات الأميلويد والألياف والأوليغومرات4،5،6،7. وقد ركزت العديد من هذه الدراسات على تحديد تكوين البروتين لهذه الرواسب الليفية المعبأة بإحكام باستخدام مرض التصلب العصبي المتعدد شبه الكمي. ومع ذلك ، فإن النتائج المتاحة غير متسقة ، والعدد الكبير بشكل مدهش من البروتينات التي تم تنقيتها بشكل سابق والتي تم الإبلاغ عنها سابقا يصعب تفسيرها.
القيد الأساسي للأدبيات الموجودة التي تصف بروتيوم الأميلويد الأساسي في أدمغة نموذج الفئران AD و AD هو أن المادة النقية تحتوي على عدد لا يمكن التحكم فيه من البروتينات المشتركة في التنقية. الهدف العام من هذه الطريقة هو التغلب على هذا القيد وتطوير تنقية كيميائية حيوية قوية لعزل نوى ألياف الأميلويد. تستخدم هذه الاستراتيجية طريقة كيميائية حيوية قائمة على الطرد المركزي لتدرج كثافة السكروز الموصوفة سابقا لعزل أجزاء الأميلويد المخصب غير القابلة للذوبان في SDS من أنسجة المخ البشرية والفئران بعد الوفاة 8,9. تعتمد هذه الطريقة على الأدبيات الموجودة ولكنها تذهب إلى أبعد من ذلك مع الموجات فوق الصوتية وغسل SDS لإزالة معظم البروتينات المرتبطة بالأميلويد المرتبطة بشكل فضفاض ، مما يؤدي إلى عزل ألياف الأميلويد عالية النقاء (الشكل 1). تتغلب الألياف التي تم تنقيتها بواسطة هذا البروتوكول على العديد من التحديات الحالية التي كثيرا ما تواجهها الدراسات الهيكلية للألياف الأميلويد المعزولة من مستخلصات الدماغ. يؤكد تصور هذه الألياف باستخدام المجهر الإلكتروني الناقل (TEM) سلامة ونقاء المواد النقية (الشكل 2). في هذه الدراسة ، يتم إذابة الألياف المعزولة وهضمها إلى الببتيدات مع التربسين ، ويمكن لتحليل MS الخالي من الملصقات أن يكشف بسهولة عن هوية البروتينات التي تشكل قلب الليف. والجدير بالذكر أن بعض هذه البروتينات لديها ميل متأصل لتشكيل تجمعات فوق جزيئية في عضيات غير مرتبطة بالغشاء. بالإضافة إلى ذلك ، ترتبط العديد من البروتينات المحددة في تحليل ألياف أميلويد بيتا (Aβ) أيضا بأمراض تنكسية عصبية أخرى ، مما يشير إلى أن هذه البروتينات قد تلعب دورا رئيسيا في اعتلالات البروتينات المتعددة.
من غير المرجح أن تغير طريقة SDS / الموجات فوق الصوتية هذه بنية نوى الألياف أو تعطلها. المواد النقية مناسبة أيضا لمجموعة واسعة من نهج التحليل البروتيني من أعلى إلى أسفل ومن أسفل إلى أعلى واستراتيجيات التحليل الهيكلي الإضافية القائمة على MS ، مثل الربط الكيميائي المتبادل أو تبادل الهيدروجين والديوتيريوم. الاسترداد الكلي باستخدام هذه الطريقة مرتفع نسبيا ، وبالتالي ، فهو مناسب للدراسات الهيكلية التفصيلية ، والتي تتطلب ميكروغرام إلى ملليغرام من المواد النقية. المواد النقية مناسبة أيضا للدراسات الهيكلية باستخدام cryoEM ومجهر القوة الذرية. ويمكن لهذا البروتوكول، بالاقتران مع وضع العلامات النظيرية المستقرة للثدييات، أن يسهل دراسات الرنين المغناطيسي النووي للحالة الصلبة (NMR) لبنية الأميلويد10.
Protocol
Representative Results
Discussion
يعد تطوير فهم واضح لبنية الأميلويد وتكوينه تحديا لعلماء الأحياء الهيكلية وعلماء الكيمياء الحيوية بسبب التعقيدات البيولوجية والقيود التجريبية في استخراج الألياف النقية من أنسجة المخ AD16,17. ألياف الأميلويد متعددة الأشكال على المستوى الجزيئي ، وتظهر مجموعة …
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من خلال منحة المعاهد الوطنية للصحة R01AG061865 إلى R.J.V. و J.N.S. يشكر المؤلفون أعضاء مجموعة أبحاث فاسار وسافاس في جامعة نورث وسترن على مناقشاتهم المدروسة. كما نتقدم بخالص الشكر للدكتور (الدكتورين). أنسجار سايمر ورالف لانغن من جامعة جنوب كاليفورنيا لمدخلاتهما الحاسمة. نشكر الدكتورة فريدة كورابوفا على إعداد العينات والتصوير المجهري الإلكتروني السلبي في مركز جامعة نورث وسترن للفحص المجهري المتقدم.
Materials
| Acclaim PepMap 100 C18 HPLC column 0.075 mm x 20 mm | Thermo Scientific | 164535 | Alternative instruments, chemicals and antibodies from other manufacturers can be used |
| Ammonium bicarbonate | Sigma-Aldrich | 9830 | |
| anti-amyloid beta (1-16) 6E10 antibody | Biolegend | 803001 | |
| anti-amyloid beta (17-24) 4G8 antibody | Biolegend | 800701 | |
| anti-amyloid beta (N terminus 82E1) antibody | IBL America | 10323 | |
| anti-amyloid fibril LOC antibody | EMD Millipore | AB2287 | |
| BCA kit | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| Bioruptor Pico Plus | Diagenode | B01020001 | |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| Collagenase | Sigma-Aldrich | C0130 | |
| Complete Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | 11697498001 | |
| Dnase I | Thermo Fisher Scientific | EN0521 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | EDS | |
| Guanidine hydrochloride | Sigma-Aldrich | G4505 | |
| HyperSep C18 Cartridges | Thermo Fisher Scientific | 60108-302 | |
| Integrated Proteomics Pipeline – IP2 | http://www.integratedproteomics.com/ | ||
| Iodoacetamide (IAA) | Sigma-Aldrich | I1149 | |
| K54 Tissue Homogenizing System Motor | Cole Parmer | Glas-Col 099C | |
| MaxQuant | https://www.maxquant.org/ | ||
| Micro BCA kit | Thermo Fisher Scientific | 23235 | |
| Nanoviper 75 μm x 50 cm | Thermo Scientific | 164942 | |
| Optima L-90K Ultracentrifuge | Beckman Coulter | BR-8101P-E | |
| Orbitrap Fusion TribridMass Spectrometer | Thermo Scientific | IQLAAEGAAPFADBMBCX | |
| Pierce C18 Spin Columns | Thermo Fisher Scientific | 89870 | |
| Precellys 24 tissue homogenizer | Bertin Instruments | P000062-PEVO0-A | |
| ProteaseMAX(TM) Surfactant Trypsin Enhancer | Promega | V2072 | |
| RawConverter | http://www.fields.scripps.edu/rawconv/ | ||
| Sodium azide | VWR | 97064-646 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | 74255 | |
| Sorvall Legend Micro 21R Microcentrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75002446 | |
| Speed Vaccum Concentrator | Labconco | 7315021 | |
| Tris-2-carboxyethylphosphine (TCEP) | Sigma-Aldrich | C4706-2G | |
| Tris-HCl | Thermo Fisher Scientific | 15568025 | |
| Trypsin Gold-Mass spec grade | Promega | V5280 | |
| UltiMate 3000 RSLCnano System | Thermo Scientific | ULTIM3000RSLCNANO |
Referenzen
- Willbold, D., Strodel, B., Schröder, G. F., Hoyer, W., Heise, H. Amyloid-type protein aggregation and prion-like properties of amyloids. Chemical Reviews. 121 (13), 8285-8307 (2021).
- Rambaran, R. N., Serpell, L. C. Amyloid fibrils: abnormal protein assembly. Prion. 2 (3), 112-117 (2008).
- Upadhyay, A., et al. Complex inclusion bodies and defective proteome hubs in neurodegenerative disease: New clues, new challenges. The Neuroscientist. , (2021).
- Greiner, E. R., Kelly, J. W., Palhano, F. L. Immunoprecipitation of amyloid fibrils by the use of an antibody that recognizes a generic epitope common to amyloid fibrils. PLOS ONE. 9 (8), 105433 (2014).
- Kourelis, T. V., et al. A proteomic atlas of cardiac amyloid plaques. JACC: CardioOncology. 2 (4), 632-643 (2020).
- Mangione, P. P., et al. Increasing the accuracy of proteomic typing by decellularisation of amyloid tissue biopsies. Journal of Proteomics. 165, 113-118 (2017).
- Rostagno, A., Neubert, T. A., Ghiso, J. Unveiling brain Aβ heterogeneity through targeted proteomic analysis. Methods in Molecular Biology. 1779, 23-43 (2018).
- Roher, A. E., et al. Morphology and toxicity of Aβ-(1-42) dimer derived from neuritic and vascular amyloid deposits of Alzheimer’s disease. Journal of Biological Chemistry. 271 (34), 20631-20635 (1996).
- Lu, J. -. X., et al. Molecular structure of β-amyloid fibrils in Alzheimer’s disease brain tissue. Cell. 154 (6), 1257-1268 (2013).
- Tycko, R. Solid-state NMR studies of amyloid fibril structure. Annual Review of Physical Chemistry. 62, 279-299 (2011).
- Saito, T., et al. Single App knock-in mouse models of Alzheimer’s disease. Nature Neuroscience. 17 (5), 661-663 (2014).
- Meyerhoff, J., et al. Microdissection of mouse brain into functionally and anatomically different regions. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (168), e61941 (2021).
- Spijker, S., Li, K. Dissection of Rodent Brain Regions. Neuroproteomics. Neuromethods. 57, (2011).
- Hark, T. J., et al. Pulse-chase proteomics of the App knockin mouse models of Alzheimer’s disease reveals that synaptic dysfunction originates in presynaptic terminals. Cell Systems. 12 (2), 141-158 (2021).
- Liu, S., et al. Highly efficient intercellular spreading of protein misfolding mediated by viral ligand-receptor interactions. Nature Communications. 12 (1), 5739 (2021).
- Toyama, B. H., Weissman, J. S. Amyloid structure: conformational diversity and consequences. Annual Review of Biochemistry. 80, 557-585 (2011).
- Sundaria, N., et al. Neurodegeneration & imperfect ageing: Technological limitations and challenges. Mechanisms of Ageing and Development. 200, 111574 (2021).
- Cendrowska, U., et al. Unraveling the complexity of amyloid polymorphism using gold nanoparticles and cryo-EM. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (12), 6866-6874 (2020).
- Seuring, C., et al. Amyloid fibril polymorphism: almost identical on the atomic level, mesoscopically very different. The Journal of Physical Chemistry B. 121 (8), 1783-1792 (2017).
- Close, W., et al. Physical basis of amyloid fibril polymorphism. Nature Communications. 9 (1), 699 (2018).
- Tycko, R. Amyloid polymorphism: Structural basis and neurobiological relevance. Neuron. 86 (3), 632-645 (2015).
- Konstantoulea, K., et al. Heterotypic Amyloid β interactions facilitate amyloid assembly and modify amyloid structure. The EMBO Journal. 41, 108591 (2022).
- Hondius, D. C., et al. Proteomics analysis identifies new markers associated with capillary cerebral amyloid angiopathy in Alzheimer’s disease. Acta Neuropathologica Communications. 6 (1), 1-19 (2018).
- Luo, J., Wärmländer, S. K., Gräslund, A., Abrahams, J. P. Cross-interactions between the Alzheimer disease amyloid-β peptide and other amyloid proteins: a further aspect of the amyloid cascade hypothesis. Journal of Biological Chemistry. 291 (32), 16485-16493 (2016).
- Hosp, F., et al. Spatiotemporal proteomic profiling of Huntington’s disease inclusions reveals widespread loss of protein function. Cell Reports. 21 (8), 2291-2303 (2017).
- Wallace, E. W. J., et al. Reversible, specific, active aggregates of endogenous proteins assemble upon heat stress. Cell. 162 (6), 1286-1298 (2015).
- Darling, A. L., Liu, Y., Oldfield, C. J., Uversky, V. N. Intrinsically disordered proteome of human membrane-less organelles. Proteomics. 18 (5-6), 1700193 (2018).
- Kepchia, D., et al. Diverse proteins aggregate in mild cognitive impairment and Alzheimer’s disease brain. Alzheimer’s Research & Therapy. 12 (1), 1-20 (2020).
- Espay, A. J., et al. Revisiting protein aggregation as pathogenic in sporadic Parkinson and Alzheimer diseases. Neurology. 92 (7), 329-337 (2019).
- Fändrich, M., Schmidt, M., Grigorieff, N. Recent progress in understanding Alzheimer’s β-amyloid structures. Trends in Biochemical Sciences. 36 (6), 338-345 (2011).
- Bonnin, E. A., Fornasiero, E. F., Lange, F., Turck, C. W., Rizzoli, S. O. NanoSIMS observations of mouse retinal cells reveal strict metabolic controls on nitrogen turnover. BMC Molecular and Cell Biology. 22 (1), 1-10 (2021).
- Michno, W., et al. Following spatial Aβ aggregation dynamics in evolving Alzheimer’s disease pathology by imaging stable isotope labeling kinetics. Science Advances. 7 (25), (2021).
- Toyama, B. H., et al. Identification of long-lived proteins reveals exceptional stability of essential cellular structures. Cell. 154 (5), 971-982 (2013).
- Bomba-Warczak, E., Edassery, S. L., Hark, T. J., Savas, J. N. Long-lived mitochondrial cristae proteins in mouse heart and brain. Journal of Cell Biology. 220 (9), 202005193 (2021).
