Intravitale widefield fluorescentiemicroscopie van pulmonale microcirculatie bij experimenteel acuut longletsel met behulp van een vacuümgestabiliseerd beeldvormingssysteem

Intravitale microscopie (IVM) is een nuttig beeldvormingsinstrument voor het visualiseren en bestuderen van verschillende biofysische processen in vivo. De long is zeer uitdagend om in vivo in beeld te brengen vanwege de ingesloten locatie, de fragiele aard van het weefsel en bewegingsartefacten veroorzaakt door ademhaling en hartslag ^1,2. Verschillende intravitale microscopie (IVM) opstellingen zijn ontwikkeld voor real-time beeldvorming van leukocyt-endotheel interacties in pulmonale microcirculatie om deze uitdagingen te overwinnen. Dergelijke benaderingen zijn gebaseerd op het chirurgisch blootstellen en stabiliseren van de long voor beeldvorming.

Dieren worden meestal voorbereid op long IVM door chirurgische ingrepen. Ten eerste worden dieren geïntubeerd en beademd, wat chirurgische excisie van een thoracale venster en daaropvolgende interventies mogelijk maakt om de long te stabiliseren voor beeldvorming. Eén techniek omvat het lijmen van het parenchym op een glazen afdekplaat³, een procedure die een aanzienlijk fysiek trauma aan het afgebeelde weefsel riskeert. Geavanceerder is het gebruik van een vacuümsysteem om de long te stabiliseren onder een glazen venster⁴. Deze opstelling vergemakkelijkt de losse hechting van het longoppervlak aan de coverslip via een omkeerbaar vacuüm verspreid over een groot lokaal gebied en breidt de long uit terwijl de beweging in x-, y- en z-dimensies⁴ nog steeds wordt beperkt. Het vacuüm wordt gelijkmatig aangebracht door een kanaal rond het beeldvormende gebied van de opstelling en trekt het weefsel in een ondiep conisch gebied tegenover de imaging-grade coverslip⁴. Via dit kijkvenster kan de longmicrocirculatie worden bestudeerd met behulp van verschillende optische beeldvormingsmodaliteiten.

Long IVM maakt kwantitatieve beeldvorming van een veelheid aan microcirculatieparameters mogelijk. Deze omvatten metingen zoals leukocytenspoorsnelheid en -lengte⁵, rode bloedcelstroomsnelheid⁶ en oxygenatie⁷, tumormetastasen⁸, het onderscheid van immuuncelsubpopulaties ^9,10,11, visualisatie van microdeeltjes¹², alveolaire dynamica^13,14, vasculaire permeabiliteit¹⁵ en capillaire functie¹⁶ . De focus ligt hier op leukocytenrekrutering en capillaire functie. Initiatie van leukocytenrekrutering in de pulmonale microcirculatie omvat voorbijgaande rollende interacties en stevige kleefinteracties tussen leukocyten en endotheelcellen, die beide verhoogd zijn onder ontstekingsomstandigheden ^16,17. Typisch wordt rollen gekwantificeerd door het aantal leukocyten dat een door de operator gedefinieerde referentielijn passeert, terwijl de adhesie wordt gekwantificeerd door het aantal leukocyten dat onbeweeglijk is op het endotheel¹⁶. Capillaire functie kan ook worden beïnvloed in inflammatoire toestanden, vaak resulterend in verminderde perfusie. Dit kan worden toegeschreven aan verschillende factoren, waaronder een vermindering van de vervormbaarheid van rode bloedcellen¹⁸ en bonte expressie van induceerbare NO-synthase door endotheelcellen, resulterend in pathologische rangering¹⁹. Doorgaans wordt de totale lengte van geperfuseerde haarvaten per gebied gemeten en gerapporteerd als functionele capillaire dichtheid (FCD).

Het bestuderen van leukocytenrekrutering in de longen in realtime vereist het labelen van biologische doelen met fluorescerende kleurstoffen of fluorescerend gelabelde antilichamen²⁰. Als alternatief kunnen verschillende transgene muizenstammen zoals lysozyme M-green fluorescent protein (LysM-GFP) muizen worden gebruikt om specifieke immuuncelsubsets zoals neutrofielen^21,22 in beeld te ^brengen. De fluorescerend gelabelde leukocyten kunnen vervolgens worden gevisualiseerd met behulp van widefield fluorescentiemicroscopie, confocale microscopie of multifotonenmicroscopie. Deze technieken bereiken contrast door gebruik te maken van specifieke excitatiegolflengten en uitgezonden fluorescentie te detecteren, terwijl tegelijkertijd de detectie van de excitatiegolflengte wordt geblokkeerd, waardoor het gelabelde object wordt gemarkeerd.

Bestaand onderzoek naar de kwantificering van leukocytenrollen, adhesie en functionele capillaire dichtheid in de muizenlong is voornamelijk gebaseerd op handmatige video-analyse. Dit wordt mogelijk gemaakt door open-source software zoals Fiji ^6,23, propriëtaire software zoals CapImage¹², of op maat gemaakte beeldverwerkingssystemen²⁴. Omgekeerd maken verschillende eigen softwareplatforms (bijv. NIS Element, Imaris, Volocity, MetaMorph) geautomatiseerde meting mogelijk van een breed scala aan andere fysiologische parameters, waaronder veel van de eerder hier genoemde 5,6,7,8,9,10,11,12,13,15.

Er zijn belangrijke observaties gedaan met betrekking tot de pathologie van acuut longletsel (ALI) en acute respiratory distress syndrome (ARDS) met behulp van long IVM. ARDS wordt gekenmerkt door een groot aantal pathofysiologische processen in de longen, waaronder longoedeem en alveolaire schade veroorzaakt door disfunctie van het endotheel en de epitheliale barrière²⁵. Met behulp van een muizenmodel is gebleken dat sepsis-geïnduceerde ALI geassocieerd is met significante schadelijke veranderingen in de handel in immuuncellen in de longomgeving²⁶. Neutrofielen die werden gerekruteerd voor de haarvaten van muizen met sepsis-geïnduceerde ALI bleken de microcirculatie te belemmeren, waardoor hypoxie in ALI²⁶ toenam. Daarnaast is IVM gebruikt om inzicht te krijgen in het onderliggende reparatiemechanisme na het begin van ARDS²⁷. Long IVM is ook een waardevol hulpmiddel geweest bij het begrijpen van pathofysiologische veranderingen in verschillende obstructieve longziekten. Visualisatie van slijmtransport bij ziekten zoals cystic fibrosis (CF) en chronische obstructieve longziekte (COPD) heeft bijvoorbeeld de studie van nieuwe en bestaande behandelingen voor slijmklaring^{vergemakkelijkt 28}. Leukocytenhandel onder deze omstandigheden is ook geanalyseerd¹⁷.

Dit protocol borduurt voort op de aanpak die oorspronkelijk werd beschreven door Lamm et ^al.29 om leukocyten-endotheelinteracties te bestuderen met behulp van conventionele fluorescentiemicroscopie. De beschreven procedures maken gebruik van een in vivo longbeeldvormingssysteem, dat een metalen basis van 16,5 cm x 12,7 cm, micromanipulator en vacuümbeeldvormingsvenster omvat (figuur 1). Het systeem is gemonteerd in een 20 cm x 23,5 cm 3D-geprint platform (Supplemental File 1) om een veilige bevestiging voor de ventilatorbuis en het verwarmingskussen te bieden. Deze methode biedt reproduceerbare en kwantificeerbare beeldvorming van murine pulmonale microcirculatie in vivo. Belangrijke aspecten van de chirurgische voorbereiding en het juiste gebruik van een vacuümgestabiliseerd longbeeldvormingssysteem worden in detail uitgelegd. Ten slotte wordt een experimenteel model van ALI gebruikt om representatieve beeldvorming en analyse te bieden van veranderde leukocytenrollen, leukocytenadhesie en capillaire perfusie geassocieerd met ontsteking. Het gebruik van dit protocol moet verder belangrijk onderzoek naar pathofysiologische veranderingen in de pulmonale microcirculatie tijdens acute ziektetoestanden vergemakkelijken.