Microscopie à fluorescence intravitale à grand champ de la microcirculation pulmonaire dans une lésion pulmonaire aiguë expérimentale à l’aide d’un système d’imagerie stabilisé sous vide

La microscopie intravitale (MIV) est un outil d’imagerie utile pour visualiser et étudier divers processus biophysiques in vivo. Le poumon est très difficile à imager in vivo en raison de son emplacement fermé, de la nature fragile de ses tissus et des artefacts de mouvement induits par la respiration et le rythme cardiaque ^1,2. Diverses configurations de microscopie intravitale (MIV) ont été développées pour l’imagerie en temps réel des interactions leucocytaires-endothéliales dans la microcirculation pulmonaire afin de surmonter ces défis. De telles approches sont basées sur l’exposition chirurgicale et la stabilisation du poumon pour l’imagerie.

Les animaux sont généralement préparés pour la MIV pulmonaire par des interventions chirurgicales. Tout d’abord, les animaux sont intubés et ventilés, ce qui permet l’excision chirurgicale d’une fenêtre thoracique et des interventions ultérieures pour stabiliser le poumon pour l’imagerie. Une technique consiste à coller le parenchyme sur un couvercle de verre³, une procédure qui risque de causer un traumatisme physique important au tissu imagé. Plus avancée est l’utilisation d’un système de vide pour stabiliser le poumon sous une fenêtre en verre⁴. Cette configuration facilite l’adhérence lâche de la surface du poumon au couvercle via un vide réversible réparti sur une grande zone locale et dilate le poumon tout en limitant le mouvement dans les dimensions x, y et z⁴. Le vide est appliqué uniformément à travers un canal entourant la zone d’imagerie de la configuration et tire le tissu dans une région conique peu profonde faisant face au couvercle⁴ de qualité d’imagerie. Grâce à cette fenêtre de visualisation, la microcirculation pulmonaire peut être étudiée à l’aide de diverses modalités d’imagerie optique.

La MIV pulmonaire permet l’imagerie quantitative d’une multitude de paramètres microcirculatoires. Il s’agit notamment de mesures telles que la vitesse et la longueur de la piste des leucocytes⁵, la vitesse^{d’écoulement} des globules rouges 6 et l’oxygénation⁷, les métastases tumorales⁸, la distinction des sous-populations de cellules immunitaires ^9,10,11, la visualisation des microparticules¹², la dynamique alvéolaire ^13,14, la perméabilité vasculaire¹⁵ et la fonction capillaire¹⁶ . L’accent est mis ici sur le recrutement des leucocytes et la fonction capillaire. L’initiation du recrutement des leucocytes dans la microcirculation pulmonaire implique des interactions de roulement transitoires et des interactions adhésives fermes entre les leucocytes et les cellules endothéliales, qui sont toutes deux augmentées dans des conditions inflammatoires^16,17. Typiquement, le laminage est quantifié par le nombre de leucocytes qui passent une ligne de référence définie par l’opérateur, tandis que l’adhérence est quantifiée par le nombre de leucocytes immobiles sur l’endothélium¹⁶. La fonction capillaire peut également être affectée dans les états inflammatoires, entraînant souvent une diminution de la perfusion. Cela peut être attribué à plusieurs facteurs, notamment une réduction de la déformabilité des globules rouges¹⁸ et l’expression panachée de la NO synthase inductible par les cellules endothéliales entraînant une dérivation pathologique¹⁹. En règle générale, la longueur agrégée des capillaires perfusés par zone est mesurée et rapportée en densité capillaire fonctionnelle (FCD).

L’étude du recrutement des leucocytes dans les poumons en temps réel nécessite de marquer des cibles biologiques avec des colorants fluorescents ou des anticorps marqués par fluorescence²⁰. Alternativement, diverses souches de souris transgéniques telles que les souris lysozyme M-green fluorescent protein (LysM-GFP) peuvent être utilisées pour imager des sous-ensembles de cellules immunitaires spécifiques tels que les neutrophiles^21,22. Les leucocytes marqués par fluorescence peuvent ensuite être visualisés à l’aide de la microscopie à fluorescence à grand champ, de la microscopie confocale ou de la microscopie multiphotonique. Ces techniques permettent d’obtenir un contraste en utilisant des longueurs d’onde d’excitation spécifiques et en détectant la fluorescence émise tout en bloquant simultanément la détection de la longueur d’onde d’excitation, mettant ainsi en évidence l’objet étiqueté.

Les recherches existantes concernant la quantification du roulement des leucocytes, de l’adhérence et de la densité capillaire fonctionnelle dans le poumon murin reposent principalement sur l’analyse vidéo manuelle. Ceci est rendu possible grâce à des logiciels open source tels que Fiji ^6,23, des logiciels propriétaires tels que CapImage¹² ou des systèmes de traitement d’image sur mesure²⁴. Inversement, diverses plates-formes logicielles propriétaires (par exemple, NIS Element, Imaris, Volocity, MetaMorph) permettent la mesure automatisée d’un large éventail d’autres paramètres physiologiques, y compris beaucoup de ceux mentionnés précédemment ici ^{5,6,7,8,9,10,11,12,13,15}.

Des observations importantes ont été faites concernant la pathologie des lésions pulmonaires aiguës (AIP) et du syndrome de détresse respiratoire aiguë (SDRA) à l’aide de la MIV pulmonaire. Le SDRA est caractérisé par une foule de processus physiopathologiques dans les poumons, y compris l’œdème pulmonaire et les dommages alvéolaires causés par un dysfonctionnement de l’endothélium et de la barrière épithéliale²⁵. En utilisant un modèle murin, il a été constaté que la SA induite par la septicémie est associée à des changements préjudiciables importants dans le trafic de cellules immunitaires dans l’environnement pulmonaire²⁶. Les neutrophiles recrutés dans les capillaires de souris atteintes d’ALI induite par la septicémie ont empêché la microcirculation, augmentant ainsi l’hypoxie dans l’ALI²⁶. En outre, la MIV a été utilisée pour mieux comprendre le mécanisme sous-jacent de réparation après l’apparition du SDRA²⁷. La MIV pulmonaire a également été un outil précieux pour comprendre les changements physiopathologiques dans diverses maladies pulmonaires obstructives. Par exemple, la visualisation du transport du mucus dans des maladies telles que la fibrose kystique (FK) et la maladie pulmonaire obstructive chronique (MPOC) a facilité l’étude de traitements nouveaux et existants pour la clairance muqueuse²⁸. Le trafic de leucocytes dans ces conditions a également été analysé¹⁷.

Ce protocole élargit l’approche initialement décrite par Lamm et ^al.29 pour étudier les interactions leucocytaires-endothéliales en utilisant la microscopie à fluorescence conventionnelle. Les procédures décrites utilisent un système d’imagerie pulmonaire in vivo , qui comprend une base métallique de 16,5 cm x 12,7 cm, un micromanipulateur et une fenêtre d’imagerie sous vide (Figure 1). Le système est monté sur une plate-forme imprimée en 3D de 20 cm x 23,5 cm (fichier supplémentaire 1) afin de fournir une fixation sécurisée pour le tube de ventilateur et le coussin chauffant. Cette méthode offre une imagerie reproductible et quantifiable de la microcirculation pulmonaire murine in vivo. Les aspects importants de la préparation chirurgicale ainsi que l’utilisation correcte d’un système d’imagerie pulmonaire stabilisé sous vide sont expliqués en détail. Enfin, un modèle expérimental d’ALI est utilisé pour fournir une imagerie et une analyse représentatives du roulage altéré des leucocytes, de l’adhésion des leucocytes et de la perfusion capillaire associée à l’inflammation. L’utilisation de ce protocole devrait faciliter d’autres recherches importantes sur les changements physiopathologiques de la microcirculation pulmonaire au cours des états pathologiques aigus.