真空安定化イメージングシステムを用いた実験的急性肺損傷における肺微小循環の生体内広視野蛍光顕微鏡

インバイタル顕微鏡(IVM)は、生体内のさまざまな生物物理学的プロセスを視覚化および研究するための有用なイメージングツールです。肺は、その囲まれた位置、その組織の脆弱な性質、および呼吸および心拍によって誘発される運動アーチファクトのために、インビボで画像化することは非常に困難である^1,2。これらの課題を克服するために、肺微小循環における白血球-内皮相互作用のリアルタイムイメージングのために、さまざまな生体内顕微鏡(IVM)セットアップが開発されています。このようなアプローチは、画像化のために肺を外科的に露出させ、安定化させることに基づいている。

動物は、典型的には、外科的処置によって肺IVMのために調製される。まず、動物を挿管して換気し、胸部窓の外科的切除とその後の介入を可能にして、画像化のために肺を安定させる。1つの技法は、実質をガラスカバースリップ³に接着することを含み、これは、画像化された組織に重大な物理的外傷のリスクを冒す手順である。より高度なのは、ガラス窓⁴の下で肺を安定させるための真空システムの利用である。このセットアップは、広い局所領域に広がる可逆的真空を介して肺表面のカバースリップへの緩やかな接着を容易にし、x、y、およびz寸法⁴での動きを制限しながら肺を膨張させる。真空は、セットアップの撮像領域を囲むチャネルを介して均等に適用され、組織を撮像グレードのカバースリップ⁴に面した浅い円錐形領域に引き込む。この覗き窓を通して、肺微小循環は、様々な光学画像化モダリティを用いて研究することができる。

肺IVMは、多数の微小循環パラメータの定量的イメージングを可能にします。これらには、白血球トラック速度および長さ⁵、赤血球流速⁶および酸素化⁷、腫瘍転移⁸、免疫細胞亜集団⁹、^10、11の区別、微粒子12の可視化^、肺胞動態^13、14、血管透過性15^、および毛細血管機能¹⁶などの測定が含まれる。.ここでの焦点は、白血球の動員と毛細血管機能にあります。肺微小循環における白血球動員の開始は、白血球と内皮細胞との間の一過性の転がり相互作用および強固な接着相互作用を伴い、どちらも炎症条件下で増加する^16,17。典型的には、圧延は、オペレータ定義の基準線を通過する白血球の数によって定量化され、一方、接着は、内皮¹⁶上で不動である白血球の数によって定量化される。毛細血管機能はまた、炎症状態において影響を受ける可能性があり、しばしば灌流の減少をもたらす。これは、赤血球変形能^の低下18および病理学的シャント¹⁹をもたらす内皮細胞による誘導性NO合成酵素の多彩な発現を含むいくつかの要因に起因し得る。典型的には、面積当たりの灌流毛細血管の凝集体長が測定され、機能的毛細血管密度(FCD)として報告される。

肺における白血球動員をリアルタイムで研究するには、蛍光色素または蛍光標識抗体²⁰で生物学的標的を標識する必要がある。あるいは、リゾチームM−green蛍光タンパク質(LysM−GFP)マウスなどの様々なトランスジェニックマウス系統を利用して、好中球^21、22などの特異的免疫細胞サブセットを画像化することができる。蛍光標識された白血球は、次いで、広視野蛍光顕微鏡、共焦点顕微鏡、または多光子顕微鏡を用いて可視化することができる。これらの技術は、特定の励起波長を利用し、放出された蛍光を検出すると同時に、励起波長の検出を遮断することによってコントラストを達成し、標識された物体を強調する。

マウス肺における白血球の転がり、接着、および機能的毛細血管密度の定量化に関する既存の研究は、主に手動ビデオ分析に依存してきた。これは、Fiji ^6,23などのオープンソースソフトウェア、CapImage¹²などの独自のソフトウェア、またはカスタムメイドの画像処理システム²⁴によって可能になります。逆に、様々なプロプライエタリなソフトウェアプラットフォーム(例えば、NIS Element、Imaris、Volocity、MetaMorph)は、ここで以前に言及したものの多くを含む、広範囲の他の生理学的パラメータの自動測定を可能にする⁵、⁶、⁷、⁸、⁹、^10、11、^12、13、15。

肺IVMを用いた急性肺損傷(ALI)および急性呼吸窮迫症候群(ARDS)の病理に関して重要な観察がなされている。ARDSは、肺水腫および肺胞障害を含む肺における多数の病態生理学的プロセスによって特徴付けられる、内皮および上皮障壁²⁵の機能不全によって引き起こされる。マウスモデルを用いて、敗血症誘発性ALIが肺環境における免疫細胞輸送における有意な有害な変化と関連していることが見出された²⁶。敗血症誘発性ALIを有するマウスの毛細血管に動員された好中球は、微小循環を妨害し、それによってALI²⁶における低酸素症を増加させることが見出された。さらに、IVMは、ARDS²⁷の発症後の修復の根底にあるメカニズムについての洞察を得るために使用されている。肺IVMはまた、様々な閉塞性肺疾患における病態生理学的変化を理解する上で貴重なツールとなっている。例えば、嚢胞性線維症(CF)および慢性閉塞性肺疾患(COPD)などの疾患における粘液輸送の可視化は、粘液クリアランスに対する新規および既存の治療法の研究を促進している²⁸。これらの条件下での白血球の密売も分析されている¹⁷.

このプロトコールは、Lammら²⁹ によって最初に記載されたアプローチを拡張し、従来の蛍光顕微鏡を用いて白血球-内皮相互作用を研究する。説明されている手順は、16.5 cm x 12.7 cmの金属ベース、マイクロマニピュレータ、および真空イメージングウィンドウを含む in vivo 肺イメージングシステムを採用しています(図1)。このシステムは、20 cm x 23.5 cm の3Dプリントプラットフォーム(補足ファイル1)に取り付けられ、換気チューブと加熱パッドにしっかりと取り付けることができます。この方法は、 インビボでのマウス肺微小循環の再現性および定量化可能なイメージングを提供する。外科的準備の重要な側面、ならびに真空安定化肺画像化システムの適切な利用について詳細に説明される。最後に、ALIの実験モデルを用いて、炎症に関連する変化した白血球転がり、白血球接着、および毛細血管灌流の代表的な画像化および分析を提供する。このプロトコールの使用は、急性疾患状態における肺微小循環の病態生理学的変化に関するさらなる重要な調査を容易にするはずである。