Microscopia a fluorescenza intravitale a campo largo della microcircolazione polmonare polmonare polmonare acuta sperimentale utilizzando un sistema di imaging stabilizzato sotto vuoto

La microscopia intravitale (IVM) è un utile strumento di imaging per visualizzare e studiare vari processi biofisici in vivo. Il polmone è molto difficile da fotografare in vivo a causa della sua posizione chiusa, della natura fragile del suo tessuto e degli artefatti di movimento indotti dalla respirazione e dal battito cardiaco ^1,2. Sono state sviluppate varie configurazioni di microscopia intravitale (IVM) per l’imaging in tempo reale delle interazioni leucocita-endoteliali nella microcircolazione polmonare per superare queste sfide. Tali approcci si basano sull’esposizione chirurgica e sulla stabilizzazione del polmone per l’imaging.

Gli animali sono in genere preparati per l’IVM polmonare mediante procedure chirurgiche. In primo luogo, gli animali vengono intubati e ventilati, il che consente l’escissione chirurgica di una finestra toracica e successivi interventi per stabilizzare il polmone per l’imaging. Una tecnica prevede l’incollaggio del parenchima su un coverslip³ di vetro, una procedura che rischia un trauma fisico significativo al tessuto ripreso. Più avanzato è l’utilizzo di un sistema di vuoto per stabilizzare il polmone sotto una finestra di vetro⁴. Questa configurazione facilita l’aderenza sciolta della superficie polmonare al coverslip tramite un vuoto reversibile distribuito su una vasta area locale ed espande il polmone limitando comunque il movimento nelle dimensioni x, y e z⁴. Il vuoto viene applicato uniformemente attraverso un canale che circonda l’area di imaging della configurazione e tira il tessuto in una regione conica poco profonda di fronte al coverslip⁴ di grado di imaging. Attraverso questa finestra di visualizzazione, la microcircolazione polmonare può essere studiata utilizzando varie modalità di imaging ottico.

Lung IVM consente l’imaging quantitativo di una moltitudine di parametri microcircolatori. Questi includono misurazioni come la velocità e la lunghezza della traccia leucocitaria⁵, la velocità del flusso dei globuli rossi⁶ e l’ossigenazione⁷, le metastasi tumorali⁸, la distinzione delle sottopopolazioni di cellule immunitarie ^9,10,11, la visualizzazione delle microparticelle¹², la dinamica alveolare ^13,14, la permeabilità vascolare¹⁵ e la funzione capillare ¹⁶ . L’attenzione qui è sul reclutamento dei leucociti e sulla funzione capillare. L’inizio del reclutamento dei leucociti nella microcircolazione polmonare comporta interazioni transitorie di rotolamento e interazioni adesive solide tra leucociti e cellule endoteliali, entrambe aumentate in condizioni infiammatorie^16,17. Tipicamente, il rotolamento è quantificato dal numero di leucociti che passano una linea di riferimento definita dall’operatore, mentre l’adesione è quantificata dal numero di leucociti che sono immobili sull’endotelio¹⁶. La funzione capillare può anche essere influenzata negli stati infiammatori, spesso con conseguente diminuzione della perfusione. Ciò può essere attribuito a diversi fattori, tra cui una riduzione della deformabilità dei globuli rossi¹⁸ e l’espressione variegata di NO sintasi inducibile da parte delle cellule endoteliali con conseguente smistamento patologico¹⁹. Tipicamente, la lunghezza aggregata dei capillari perfusi per area viene misurata e riportata come densità capillare funzionale (FCD).

Studiare il reclutamento dei leucociti nei polmoni in tempo reale richiede l’etichettatura di bersagli biologici con coloranti fluorescenti o anticorpi marcati fluorescenti²⁰. In alternativa, vari ceppi di topo transgenico come i topi lysozyme M-green fluorescent protein (LysM-GFP) possono essere utilizzati per visualizzare specifici sottoinsiemi di cellule immunitarie come i neutrofili^21,22. I leucociti marcati fluorescenti possono quindi essere visualizzati utilizzando la microscopia a fluorescenza a campo largo, la microscopia confocale o la microscopia multifotonica. Queste tecniche raggiungono il contrasto utilizzando specifiche lunghezze d’onda di eccitazione e rilevando la fluorescenza emessa, bloccando contemporaneamente il rilevamento della lunghezza d’onda di eccitazione, evidenziando così l’oggetto etichettato.

La ricerca esistente riguardante la quantificazione del rotolamento dei leucociti, l’adesione e la densità capillare funzionale nel polmone murino si è basata principalmente sull’analisi video manuale. Ciò è reso possibile da software open source come Fiji ^6,23, software proprietario come CapImage¹² o sistemi di elaborazione delle immagini personalizzati²⁴. Al contrario, varie piattaforme software proprietarie (ad esempio, NIS Element, Imaris, Volocity, MetaMorph) consentono la misurazione automatizzata di una vasta gamma di altri parametri fisiologici, tra cui molti di quelli precedentemente menzionati qui 5,6,7,8,9,10,11,12,13,15.

Importanti osservazioni sono state fatte per quanto riguarda la patologia della lesione polmonare acuta (ALI) e della sindrome da distress respiratorio acuto (ARDS) utilizzando IVM polmonare. L’ARDS è caratterizzata da una serie di processi fisiopatologici nel polmone, tra cui edema polmonare e danno alveolare causato da disfunzione dell’endotelio e della barriera epiteliale²⁵. Utilizzando un modello murino, è stato scoperto che l’ALI indotta dalla sepsi è associata a significativi cambiamenti dannosi nel traffico di cellule immunitarie nell’ambiente polmonare²⁶. I neutrofili reclutati nei capillari dei topi con ALI indotta da sepsi sono stati trovati per impedire la microcircolazione, aumentando così l’ipossia in ALI²⁶. Inoltre, IVM è stato utilizzato per ottenere informazioni sul meccanismo di riparazione sottostante dopo l’inizio di ARDS²⁷. Lung IVM è stato anche uno strumento prezioso per comprendere i cambiamenti fisiopatologici in varie malattie polmonari ostruttive. Ad esempio, la visualizzazione del trasporto di muco in malattie come la fibrosi cistica (FC) e la broncopneumopatia cronica ostruttiva (BPCO) ha facilitato lo studio di trattamenti nuovi ed esistenti per la clearance mucosa²⁸. Il traffico di leucociti in queste condizioni è stato analizzato anche¹⁷.

Questo protocollo espande l’approccio inizialmente descritto da Lamm et ^al.29 per studiare le interazioni leucocita-endoteliali utilizzando la microscopia a fluorescenza convenzionale. Le procedure descritte impiegano un sistema di imaging polmonare in vivo , che include una base metallica di 16,5 cm x 12,7 cm, un micromanipolatore e una finestra di imaging a vuoto (Figura 1). Il sistema è montato in una piattaforma stampata 3D di 20 cm x 23,5 cm (file supplementare 1) per fornire un fissaggio sicuro per il tubo del ventilatore e la piastra riscaldante. Questo metodo offre immagini riproducibili e quantificabili della microcircolazione polmonare murina in vivo. Aspetti importanti della preparazione chirurgica e il corretto utilizzo di un sistema di imaging polmonare stabilizzato sotto vuoto sono spiegati in dettaglio. Infine, un modello sperimentale di ALI viene utilizzato per fornire immagini e analisi rappresentative del rotolamento alterato dei leucociti, dell’adesione dei leucociti e della perfusione capillare associata all’infiammazione. L’uso di questo protocollo dovrebbe facilitare ulteriori importanti indagini sui cambiamenti fisiopatologici nella microcircolazione polmonare durante gli stati di malattia acuta.