Summary

Produção de células CAR-T projetadas por CRISPR humanas

Published: March 15, 2021
doi:

Summary

Aqui, apresentamos um protocolo para edição de genes em células T humanas primárias usando a tecnologia CRISPR Cas para modificar células CAR-T.

Abstract

Terapias celulares adotivas usando células T do receptor de antígeno quimérico (células CAR-T) demonstraram notável eficácia clínica em pacientes com malignidades hematológicas e estão atualmente sendo investigadas para vários tumores sólidos. As células CAR-T são geradas removendo células T do sangue de um paciente e projetando-as para expressar um receptor imunológico sintético que redireciona as células T para reconhecer e eliminar células tumorais alvo. A edição de genes das células CAR-T tem o potencial de melhorar a segurança das terapias atuais de células CAR-T e aumentar ainda mais a eficácia das células CAR-T. Aqui, descrevemos métodos para ativação, expansão e caracterização de células CAR-T direcionadas por CRISPR. Isso compreende a transdução do vetor lentiviral CAR e o uso de RNA guia único (sgRNA) e Cas9 endonuclease para atingir genes de interesse em células T. Os métodos descritos neste protocolo podem ser universalmente aplicados a outras construções car e genes-alvo além dos utilizados neste estudo. Além disso, este protocolo discute estratégias para o design de gRNA, seleção de gRNA de chumbo e validação de genes-alvo para alcançar de forma reproduibivelmente alta eficiência, engenharia multiplex CRISPR-Cas9 de células T humanas de grau clínico.

Introduction

A terapia celular quimérico de antígeno (CAR)-T revolucionou o campo das terapias celulares adotivas e da imunoterapia contra o câncer. As células CAR-T são células T projetadas expressando um receptor imunológico sintético que combina um fragmento de anticorpo de cadeia única específico de antígeno com domínios de sinalização derivados da cadeia TCRzeta e domínios costimulatórios necessários e suficientes para ativação e co-estimulação de células T1,2,3,4 . A fabricação de células CAR-T começa extraindo as próprias células T do paciente, seguida pela transdução viral ex vivo do módulo CAR e expansão do produto celular CAR-T com contas magnéticas que funcionam como antígenos artificiais apresentando células5. As células CAR-T expandidas são reinfundidas no paciente onde podem engrafar, eliminar células tumorais alvo e até persistir por vários anos após a infusão6,7,8. Embora a terapia celular CAR-T tenha resultado em taxas notáveis de resposta em malignidades de células B, o sucesso clínico para tumores sólidos tem sido desafiado por múltiplos fatores, incluindo a má infiltração de células T9,um microambiente tumoral imunossupressor10,cobertura e especificidade de antígenos, e disfunção celular CAR-T11,12 . Outra limitação da terapia celular CAR-T atual inclui o uso de células T autólogas. Após várias rodadas de quimioterapia e alta carga tumoral, as células CAR-T podem ser de má qualidade em comparação com produtos CAR-T aogeneicos de doadores saudáveis, além do tempo e despesas associados à fabricação de células CAR-T autólogas. A edição de genes do produto car-t por CRISPR/Cas9 representa uma nova estratégia para superar as limitações atuais das células CAR-T13,14,15,16,17.

CRISPR/Cas9 é um sistema de dois componentes que pode ser usado para edição de genomas direcionados em células de mamíferos18,19. O Endonuclease Cas9 associado ao CRISPR pode induzir quebras de dois fios específicas do local guiadas por pequenos RNAs através do emparelhamento de base com a sequência de DNAalvo 20. Na ausência de um modelo de reparo, as quebras de dois fios são reparadas pela via de junção final nonhomologous propensa a erros (NHEJ), resultando em mutações de mudança de quadro ou codons de parada prematura através de mutações de inserção e exclusão (INDELs)19,20,21. Eficiência, facilidade de uso, custo-efetividade e a capacidade de edição de genoma multiplex fazem do CRISPR/Cas9 uma ferramenta poderosa para aumentar a eficácia e a segurança das células CAR-T autólogas e aogenéticas. Essa abordagem também pode ser usada para editar células T direcionadas tcr substituindo a construção do CAR por um TCR. Além disso, células CAR-T aogenéticas que têm potencial limitado para causar enxerto versus doença hospedeira também podem ser geradas pela edição de genes do lócus TCR, b2m e HLA.

Neste protocolo, mostramos como a engenharia CRISPR de células T pode ser combinada com a entrega mediada por vetores virais do CAR-Transgene para gerar produtos celulares CAR-T editados por genoma com maior eficácia e segurança. Um diagrama esquemático de todo o processo é mostrado na Figura 1. Usando essa abordagem, demonstramos um nocaute genético de alta eficiência nas células CAR-T humanas primárias. A Figura 2A descreve em detalhes a linha do tempo de cada etapa para edição e fabricação de células T. Estratégias para o design de RNA guia e validação de nocaute também são discutidas para aplicar essa abordagem a vários genes-alvo.

Protocol

As células T humanas foram adquiridas através do Núcleo de Imunologia Humana da Universidade da Pensilvânia, que opera sob princípios de Boas Práticas laboratoriais com procedimentos operacionais padrão estabelecidos e/ou protocolos para recebimento de amostras, processamento, congelamento e análise de acordo com as diretrizes éticas da MIATA e da Universidade da Pensilvânia. 1. Produção de vetores lentiviral NOTA: Os produtos virais foram transformados co…

Representative Results

Descrevemos aqui um protocolo para criar geneticamente células T, que podem ser usadas para gerar células CAR-T autólogas e aogenéricas, bem como células T redirecionadas T. A Figura 1 fornece uma descrição detalhada das etapas envolvidas no processo de fabricação de células T editadas pelo CRISPR. O processo começa projetando sgRNA para o gene de interesse. Uma vez que o sgRNA é projetado e sintetizado, eles são então usados para fazer complexos RNP…

Discussion

Aqui descrevemos abordagens para editar células CAR-T de genes usando a tecnologia CRISPR Cas9 e fabricar produtos para testar melhor a função e eficácia. O protocolo acima foi otimizado para a realização da edição de genes CRIPSR em células T humanas primárias combinadas com células T de engenharia com receptores de antígeno quimérico. Este protocolo permite alta eficiência de nocaute com variabilidade mínima de doador para doador. A modificação usando CRISPR pode melhorar tanto a eficácia quanto a seg…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Reconhecemos o Núcleo de Imunologia Humana por fornecer células T doadoras normais e o Núcleo de Citometria de Fluxo da Universidade da Pensilvânia.

Materials

4D-Nucleofactor Core Unit Lonza AAF-1002B
4D-Nucleofactor X-Unit Lonza AAF-1002X
Accuprime Pfx Supermix ThermoFisher 12344040
Beckman Optima XPN ultracentrifuge Beckman Coulter
Brilliant Violet 605 anti-human CD3 Antibody Biolegend 317322 Clone OKT3
BV711 Anti-human PD1 Biolegend Clone EH12.2H7
Cas9-Electroporation enhancers IDT 1075915
CD3/CD28 Dynabeads ThermoFisher 40203D
CD4+ T cell isolation Kit StemCell technologies 15062
CD8+ T cell isolation Kit StemCell technologies 15063
Corning 0.45 micron vacuum filter/bottle Corning 430768
Corning T150 cell culture flask Millipore Sigma CLS430825
DMSO Millipore Sigma D2650
DNAeasy Blood and Tissue Kit Qiagen 69504
DynaMag Magnet ThermoFisher 12321D
Glutamax supplement ThermoFisher 35050061
HEK293T cells ATCC CRL-3216
HEPES (1 M) ThermoFisher 15630080
huIL-15 PeproTech 200-15
huIL-7 PeproTech 200-07
Lipofectamine 2000 ThermoFisher 11668019
Nucleospin Gel and PCR cleanup Takara 740609.25
Opti-MEM ThermoFisher 31985062
P3 Primary cell 4D-nucleofactor X Kit L Lonza V4XP-3024
Penicilin-Streptomycin-Glutamine ThermoFisher 10378016
pTRPE expression Plasmid in house
Rabbit Anti-Mouse FMC63 scFv Monoclonal Antibody, (R19M), PE CytoArt 200105
RPMI1640 ThermoFisher 12633012
sgRNA IDT
Spy Fi Cas9 Aldevron 9214
Ultracentrifuge tubes Beckman Coulter 326823
Viral packaging mix in house
X-Vivo-15 Media Lonza BE02-060F

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Agarwal, S., Wellhausen, N., Levine, B. L., June, C. H. Production of Human CRISPR-Engineered CAR-T Cells. J. Vis. Exp. (169), e62299, doi:10.3791/62299 (2021).

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