Production de cellules CAR-T humaines conçues par CRISPR

La thérapie cellulaire par récepteur de l’antigène chimérique (CAR)-T a révolutionné le domaine des thérapies cellulaires adoptives et de l’immunothérapie du cancer. Les cellules CAR-T sont des cellules T modifiées exprimant un récepteur immunitaire synthétique qui combine un fragment d’anticorps à chaîne unique spécifique à l’antigène avec des domaines de signalisation dérivés de la chaîne TCRzeta et des domaines costimulatoires nécessaires et suffisants pour l’activation et la co-stimulation des lymphocytes T^1,2,3,4 . La fabrication de cellules CAR-T commence par l’extraction des propres cellules T du patient, suivie de la transduction virale ex vivo du module CAR et de l’expansion du produit des cellules CAR-T avec des billes magnétiques qui fonctionnent comme des cellules présentatrices d’antigènes artificiels⁵. Les cellules CAR-T expansées sont réinfusées dans le patient où elles peuvent se greffer, éliminer les cellules tumorales cibles et même persister pendant plusieurs années après la perfusion^6,7,8. Bien que la thérapie par cellules CAR-T ait entraîné des taux de réponse remarquables dans les tumeurs malignes à cellules B, le succès clinique des tumeurs solides a été remis en question par de multiples facteurs, notamment une mauvaise infiltration des cellules T^9,un microenvironnement tumoral immunosuppresseur^10,la couverture et la spécificité de l’antigène et le dysfonctionnement des cellules CAR-T^11,12 . Une autre limitation de la thérapie cellulaire CAR-T actuelle comprend l’utilisation de cellules T autologues. Après plusieurs cycles de chimiothérapie et une charge tumorale élevée, les cellules CAR-T peuvent être de mauvaise qualité par rapport aux produits CAR-T allogéniques de donneurs sains, en plus du temps et des dépenses associés à la fabrication de cellules CAR-T autologues. L’édition génétique du produit de cellules CAR-T par CRISPR/Cas9 représente une nouvelle stratégie pour surmonter les limites actuelles des cellules CAR-T^{13,14,15,16,17}.

CRISPR/Cas9 est un système à deux composants qui peut être utilisé pour l’édition ciblée du génome dans les cellules de mammifères^18,19. L’endonucléase Cas9 associée à CRISPR peut induire des cassures double brin spécifiques au site guidées par de petits ARN grâce à l’appariement de bases avec la séquence d’ADN cible²⁰. En l’absence d’un gabarit de réparation, les ruptures double brin sont réparées par la voie d’assemblage d’extrémité non homologique (NHEJ) sujette aux erreurs, entraînant des mutations de décalage de trame ou des codons d’arrêt prématurés par des mutations d’insertion et de délétion (INDELs)^19,20,21. L’efficacité, la facilité d’utilisation, la rentabilité et la capacité d’édition du génome multiplex font de CRISPR/Cas9 un outil puissant pour améliorer l’efficacité et la sécurité des cellules CAR-T autologues et allogéniques. Cette approche peut également être utilisée pour modifier les cellules T dirigées par TCR en remplaçant la construction CAR par un TCR. De plus, les cellules CAR-T allogéniques qui ont un potentiel limité de causer la maladie du greffon contre l’hôte peuvent également être générées par l’édition génique du locus TCR, b2m et HLA.

Dans ce protocole, nous montrons comment l’ingénierie CRISPR des lymphocytes T peut être combinée avec l’administration médiée par un vecteur viral du CAR-Transgene pour générer des produits de cellules CAR-T modifiés par le génome avec une efficacité et une sécurité accrues. Un diagramme schématique de l’ensemble du processus est illustré à la figure 1. En utilisant cette approche, nous avons démontré l’élimination de gènes à haute efficacité dans les cellules CAR-T humaines primaires. La figure 2A décrit en détail la chronologie de chaque étape de l’édition et de la fabrication des lymphocytes T. Des stratégies pour la conception d’ARN guide et la validation de l’élimination sont également discutées pour appliquer cette approche à divers gènes cibles.