HPLC-MS/MS를 사용하여 뉴클레오시드/뉴클레오티드 함량 측정을 위한 식물 샘플 준비
Summary
식물에서 생체 내 뉴클레오시드/뉴클레오티드 정량화를 위한 정밀하고 재현 가능한 방법은 여기에 설명된다. 이 방법은 HPLC-MS/MS를 사용합니다.
Abstract
뉴클레오시드/뉴클레오티드는 많은 세포 활동에 관여하는 핵산, 코기타산 및 코엔자임, 세포 신호 분자 및 에너지 운반선의 구성 요소입니다. 여기서, 우리는 식물에서 뉴클레오시드/뉴클레오티드 함량의 절대적 자격을 위한 신속하고 신뢰할 수 있는 방법을 설명한다. 간단히, 균질화된 식물 물질의 100 mg은 추출 버퍼 (메탄올, 아세토나이트 및 물의 비율로 2:2:1)로 추출되었다. 나중에, 시료는 동결 건조기에서 5회 농축된 다음 HPLC-MS/MS. 뉴클레오티드로 주입되어 다공성 흑연 탄소(PGC) 컬럼및 뉴클레오시드를 C18 컬럼상에 분리하였다. 각 뉴클레오시드와 뉴클레오티드의 질량 전이는 질량 분석법에 의해 모니터링되었다. 뉴클레오시드와 뉴클레오티드의 내용물은 그들의 외부 표준(ESTDs)에 대하여 정량화되었다. 따라서 이 방법을 사용하여 연구자들은 다른 식물에서 뉴클레오시드/뉴클레오티드를 쉽게 정량화할 수 있습니다.
Introduction
뉴클레오시드/뉴클레오티드는 모든 살아있는 유기체의 중심 대사 성분으로, 핵산과 니코티나미드 아데닌 디뉴클레오티드(NAD)와 같은 많은 코엔자임의 전구체이며 인지질, 글리콜리오드 및 폴리삭카라이드와 같은 거대 분자의 합성에 중요합니다. 구조적으로, 뉴클레오시드는 아데닌, 구아닌, 우라실, 시토신, 또는 티민이 될 수 있는 뉴클레오베이스를 함유하고 있으며, 리보오스 또는 데옥시리보제1,2일수 있는 슈가 모에티가 있다. 뉴클레오티드는 뉴클레오시드3의슈가 모이티의 5탄소 위치에 결합하는 최대 3개의 인산염 군을 가지고 있다. 식물에서 뉴클레오티드의 물질 대사는 종자 발아 및 잎 성장에 필수적이다4,5,6. 식물 발달에서 그들의 생리적 역할을 더 잘 이해하기 위해 생체 내의 다른 뉴클레오시드/뉴클레오티드의 절대적인 정량화를 위한 방법을 확립해야 한다.
뉴클레오시드/뉴클레오티드를 측정하는 가장 일반적으로 사용되는 접근법 중 하나는 자외선가 시동(UV-VIS) 검출기4,7,8,9,10,11과결합된 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 채용한다. 2013년, HPLC를 사용하여, Dahncke및 Witte는 아라비도시스 탈리아나7에서여러 종류의 뉴클레오시드를 정량화시켰다. 그(것)들은 야생 형 식물에 비교된 과노신 deaminase 유전자에 있는 T-DNA 삽입 돌연변이 표적화에 있는 향상된 guanosine 함량을 확인했습니다. 또 다른 피리미딘 뉴클레오시드인 시티딘도 이 방법을 사용하는 식물에서 정량적으로 검출되어 보나 피데 시티딘 데아미나아제 유전자4의식별을 초래하였다. 그러나 UV 검출기에 기초하여, 이 방법은 구아노신 또는 산토신과 같은 유사한 스펙트럼 및 보존 시간을 갖는 뉴클레오시드를 쉽게 구별할 수 없다. HPLC 방법의 검출 한계는 상대적으로 높기 때문에 시티딘, 우리딘 및 구아노신과 같은 생체 내의 핵세포의 높은 함량을 측정하는 데 자주 사용된다.
또한, 질량 분광법(GC-MS)에 결합된 가스 크로마토그래피는 또한 뉴클레오시드 측정에 사용될 수 있다. 그것에서 혜택을, Hauck et. al. 성공적으로 검출 된 uridine 및 요산, 뉴 클레 오 사이드 이화 경로의 하류 대사 산물, A. thaliana의씨앗에서12. 그러나, GC는 일반적으로 휘발성 화합물을 분리하는 데 사용되지만 열음부 물질에는 적합하지 않다. 따라서, 질량 분광법(LC-MS/MS)에 결합된 액체 크로마토그래피는 아마도 뉴클레오시드/뉴클레오티드(13)및14의생체 내 식별, 분리 및 정량화를 위한 보다 적합하고 정확한 분석 기술일 것이다. 여러 이전 연구는 HILIC 컬럼이 뉴클레오시드 및 뉴클레오티드분리(15,16) 및 동위원소 표지된 내부 표준에 사용될 수 있다고 보고하여 화합물 정량화(17)를 위해 사용되었다. 그러나 두 구성 요소는 상대적으로 비싸며 특히 상업용 동위원소 라벨 표준이 있습니다. 여기서는 뉴클레오시드/뉴클레오티드 측정을 위한 경제적으로 적용되는 LC-MS/MS 접근법을 보고합니다. 이 방법은 이미 ATP, N-6-메틸 AMP, AMP, GMP,우리딘, 시티딘, 및 의사요양1,5,6,18,식물 및 드로소필라를포함한 다양한 뉴클레오시드/뉴클레오티드의 양에 성공적으로 사용되어 왔다. 더욱이, 여기에서 보고하는 방법은 그밖 유기체에서또한 이용될 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
유기체는 정경및 비정상적인 것들을 포함하는 각종 뉴클레오시드/뉴클레오티드를 포함합니다. 그러나, 그(것)들의 기원 그리고 신진 대사 끝점, 특히 수정된 뉴클레오시드는 아직도 모호합니다. 더욱이, 뉴클레오시드/뉴클레오티드 대사의 기능및 항상성에 대한 현재의 이해는 탐구되고 확장되어야 한다. 이를 조사하기 위해서는 이러한 대사 산물 식별 및 정량화를 위한 정밀하고 금본적인 방법?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 중앙 대학 (KJQN202060), 중국 국립 자연 과학 재단 (31900907), 장쑤성의 자연 과학 재단 (BK20190528), 유전자 공학 및 생명 공학 국제 센터 (CRP / CHN20-04_EC.C) 및 중앙 대학 (LZ20)의 기초 연구 기금 (LZ20)에 의해 재정적으로 지원되었습니다.
Materials
| acetonitrile | Sigma-Aldrich | 1000291000 | |
| adenosine | Sigma-Aldrich | A9251-1G | |
| ammonium acetate | Sigma-Aldrich | 73594-100G-F | |
| AMP | Sigma-Aldrich | 01930-5G | |
| CMP | Sigma-Aldrich | C1006-500MG | |
| cytidine | Sigma-Aldrich | C122106-1G | |
| GMP | Sigma-Aldrich | G8377-500MG | |
| guanosine | Sigma-Aldrich | G6752-1G | |
| Hypercarb column | Thermo Fisher Scientific GmbH | 35005-054630 | |
| IMP | Sigma-Aldrich | 57510-5G | |
| inosine | Sigma-Aldrich | I4125-1G | |
| methanol | Sigma-Aldrich | 34860-1L-R | |
| N1-methyladenosine | Carbosynth | NM03697 | |
| O6-methylguanosine | Carbosynth | NM02922 | |
| Murashige and Skoog Medium | Duchefa Biochemie | M0255.005 | |
| Polaris 5 C18A column | Agilent Technologies | A2000050X046 | |
| pseudouridine | Carbosynth | NP11297 | |
| UMP | Sigma-Aldrich | U6375-1G | |
| uridine | Sigma-Aldrich | U3750-1G |
Referenzen
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