Summary

使用 HPLC-MS/MS 进行核苷/核苷酸含量测量的工厂样品制备

Published: February 24, 2021
doi:

Summary

此处描述了植物体内核苷酸/核苷酸定量的精确和可重复的方法。此方法采用 HPLC-MS/MS。

Abstract

核苷酸/核苷酸是核酸、糖体和酶、细胞信号分子和能量载体的构建基块,它们参与许多细胞活动。在这里,我们描述了一种快速可靠的方法,在植物核苷酸/核苷酸含量的绝对资格。简言之,用1mL的萃取缓冲液(甲醇、乙酮三酯和水的比例为2:2:1)提取了100毫克的均质植物材料。后来,样品被浓缩在冷冻干燥机中五次,然后注射到HPLC-MS/MS中。 核苷酸在多孔的石墨碳(PGC)柱上分离,核苷酸在C18柱上分离。每个核苷酸和核苷酸的质量转换都由质谱法监测。核苷酸和核苷酸的内容是根据其外部标准(ESTD)进行量化的。因此,使用这种方法,研究人员可以很容易地量化不同植物中的核苷酸/核苷酸。

Introduction

核苷酸/核苷酸是所有生物体中的核心代谢成分,核酸和许多凝血素(如烟酰胺腺苷二聚氰胺)的前体,在磷脂、甘油脂和多糖等大分子的合成中非常重要。从结构上讲,核苷酸包含一个核碱基,它可以是腺苷、瓜宁、尿素、细胞氨酸或胸腺素,以及糖莫伊蒂,它可以是核糖或脱氧核糖酶1,2。核苷酸有多达三个磷酸盐组结合到核苷酸3的糖雾的5碳位置。植物中核苷酸的新陈代谢对种子发芽和叶生长至关重要。为了更好地了解它们在植物发育中的生理作用,应建立体内不同核苷酸/核苷酸的绝对定量方法。

测量核苷酸/核苷酸的最常用方法之一采用高性能液相色谱 (HPLC) 和紫外可见 (UV-VIS) 探测器 4、7、8、9、10、11。2013年,使用HPLC,达恩克和维特量化了几种类型的核苷酸在阿拉伯多普西萨利亚纳7。与野生类植物相比,他们在瓜诺辛脱氨酶基因的T-DNA插入突变体中发现了增强的瓜诺辛含量。另一种丙酰胺核苷,环丙胺,也定量检测在植物使用这种方法,这导致鉴定一个真正的赛迪丁脱氨酶基因4。然而,基于紫外线探测器,这种方法不能轻易区分具有相似光谱和保留时间的核苷,例如瓜诺辛或异种氨酸。HPLC方法的检测极限相对较高,因此,它常用于测量体内核苷含量高,如青氨酸、尿氨酸、瓜诺辛等。

此外,气相色谱与质谱学(GC-MS)相结合,也可用于核苷测量。受益于它,哈克等。在A.thaliana12的种子中成功检测出尿素和尿酸,这是核苷代谢通路的下游代谢物。然而,GC通常用于分离挥发性化合物,但不适合热阴唇物质。因此,液相色谱与质谱学(LC-MS/MS)相结合可能是一种更合适、更准确的分析技术,用于内在识别、分离和定量核苷酸/核苷酸13、14。先前的几项研究报告说,HILIC列可用于核苷酸和核苷酸分离15,16和同位素标记的内部标准被用于化合物定量17。但是,这两个组件都相对昂贵,尤其是商业同位素标记标准。在这里,我们报告一种经济适用的LC-MS/MS方法,用于核苷酸/核苷酸测量。这种方法已经成功地用于不同核苷酸/核苷酸的量定量,包括ATP,N6-甲基-AMP,AMP,GMP,尿丁,青氨酸,和伪尿素1,5,6,18,在植物和德罗索菲拉。此外,我们在这里报告的方法也可以用于其他生物体。

Protocol

1 植物生长和材料收集 确保 阿拉伯多普西斯 种子在70%乙醇中消毒10分钟,并在用半强度的穆拉希格和Skoog营养物质制备的阿加板上播种。 在 4 °C 的黑暗下孵育含有 阿拉伯多虫 种子的板,持续 48 小时,然后在 22 °C 和 8 h 20 °C 的 16 h 光下将其转移到受控生长室中, 55 微米-2 s-1 下。 收获100毫克2周幼苗(新鲜重量),并冷冻在液氮中,用于代谢?…

Representative Results

在这里,我们展示了N1-甲基叶氨酸的识别和定量,一种已知的改性核苷,在2周大的阿拉伯多 普西斯 野生类型(Col-0)幼苗为例。质谱剖面图表明,N1-甲基甲基诺辛标准产生的产品离子为150m/z和133m/z(图2A),在Coll-0提取(图2B)中也观察到相同的轮廓。由于产品离子的丰度高达150米/z,因此选择282.1至150?…

Discussion

生物体含有各种核苷酸/核苷酸,包括规范和异常核苷酸。然而,它们的起源和代谢端点,特别是经过修改的核苷酸,仍然模糊不清。此外,目前对核苷酸/核苷酸代谢功能和平衡的理解还有待探索和扩展。为了调查它们,需要采用精确和金标准的方法来识别和量化这些代谢物。在这里,我们描述了一个使用质量谱进行核苷酸/核苷酸检测的协议。以N1-甲基甲基诺辛为例,该方法可检测低至0….

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

这项工作得到了中央大学基础研究基金(KJQN202060)、中国国家自然科学基金(31900907)、江苏省自然科学基金(BK20190528)、国际遗传工程和生物技术中心(CRP/CHN20-04_EC)和M.C的财政支持。 中央大学基础研究基金(LGZD202004)至X.L.

Materials

acetonitrile Sigma-Aldrich 1000291000
adenosine Sigma-Aldrich A9251-1G
ammonium acetate Sigma-Aldrich 73594-100G-F
AMP Sigma-Aldrich 01930-5G
CMP Sigma-Aldrich C1006-500MG
cytidine Sigma-Aldrich C122106-1G
GMP Sigma-Aldrich G8377-500MG
guanosine Sigma-Aldrich G6752-1G
Hypercarb column Thermo Fisher Scientific GmbH 35005-054630
IMP Sigma-Aldrich 57510-5G
inosine Sigma-Aldrich I4125-1G
methanol Sigma-Aldrich 34860-1L-R
N1-methyladenosine Carbosynth NM03697
O6-methylguanosine Carbosynth NM02922
Murashige and Skoog Medium Duchefa Biochemie M0255.005
Polaris 5 C18A column Agilent Technologies A2000050X046
pseudouridine Carbosynth NP11297
UMP Sigma-Aldrich U6375-1G
uridine Sigma-Aldrich U3750-1G

Referenzen

  1. Liu, B., Winkler, F., Herde, M., Witte, C. -. P., Großhans, J. A link between deoxyribonucleotide metabolites and embryonic cell-cycle control. Current Biology. 29 (7), 1187-1192 (2019).
  2. Zrenner, R., Stitt, M., Sonnewald, U., Boldt, R. Pyrimidine and purine biosynthesis and degradation in plants. Annual Review of Plant Biology. 57, 805-836 (2006).
  3. Witte, C. -. P., Herde, M. Nucleotide metabolism in plants. Plant Physiology. 182 (1), 63-78 (2020).
  4. Chen, M., Herde, M., Witte, C. -. P. Of the nine cytidine deaminase-like genes in Arabidopsis, eight are pseudogenes and only one is required to maintain pyrimidine homeostasis in vivo. Plant Physiology. 171 (2), 799-809 (2016).
  5. Chen, M., et al. m6A RNA degradation products are catabolized by an evolutionarily conserved N6-methyl-AMP deaminase in plant and mammalian cells. The Plant Cell. 30 (7), 1511-1522 (2018).
  6. Chen, M., Witte, C. -. P. A kinase and a glycosylase catabolize pseudouridine in the peroxisome to prevent toxic pseudouridine monophosphate accumulation. The Plant Cell. 32 (3), 722-739 (2020).
  7. Dahncke, K., Witte, C. -. P. Plant purine nucleoside catabolism employs a guanosine deaminase required for the generation of xanthosine in Arabidopsis. The Plant Cell. 25 (10), (2013).
  8. Jung, B., et al. Uridine-ribohydrolase is a key regulator in the uridine degradation pathway of Arabidopsis. The Plant Cell. 21 (3), 876-891 (2009).
  9. Jung, B., Hoffmann, C., Moehlmann, T. Arabidopsis nucleoside hydrolases involved in intracellular and extracellular degradation of purines. Plant Journal. 65 (5), 703-711 (2011).
  10. Riegler, H., Geserick, C., Zrenner, R. Arabidopsis thaliana nucleosidase mutants provide new insights into nucleoside degradation. New Phytologist. 191 (2), 349-359 (2011).
  11. Zrenner, R., et al. A functional analysis of the pyrimidine catabolic pathway in Arabidopsis. New Phytologist. 183 (1), 117-132 (2009).
  12. Hauck, O. K., et al. Uric acid accumulation in an Arabidopsis urate oxidase mutant impairs seedling establishment by blocking peroxisome maintenance. The Plant Cell. 26 (7), 3090-3100 (2014).
  13. Qu, C., et al. Comparative analysis of nucleosides, nucleobases, and amino acids in different parts of Angelicae Sinensis Radix by ultra high performance liquid chromatography coupled to triple quadrupole tandem mass spectrometry. Journal of Separation Science. 42 (6), 1122-1132 (2019).
  14. Zong, S. -. Y., et al. Fast simultaneous determination of 13 nucleosides and nucleobases in Cordyceps sinensis by UHPLC-ESI-MS/MS. Molecules. 20 (12), 21816-21825 (2015).
  15. Moravcová, D., et al. Separation of nucleobases, nucleosides, and nucleotides using two zwitterionic silica-based monolithic capillary columns coupled with tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography. A. 1373, 90-96 (2014).
  16. Guo, S., et al. Hydrophilic interaction ultra-high performance liquid chromatography coupled with triple quadrupole mass spectrometry for determination of nucleotides, nucleosides and nucleobases in Ziziphus plants. Journal of Chromatography. A. 1301, 147-155 (2013).
  17. Seifar, R. M., et al. Simultaneous quantification of free nucleotides in complex biological samples using ion pair reversed phase liquid chromatography isotope dilution tandem mass spectrometry. Analytical Biochemistry. 388 (2), 213-219 (2009).
  18. Baccolini, C., Witte, C. -. P. AMP and GMP catabolism in Arabidopsis converge on xanthosine, which is degraded by a nucleoside hydrolase heterocomplex. The Plant Cell. 31 (3), 734-751 (2019).

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Diesen Artikel zitieren
Zhu, C., Liu, X., Wang, W., Chen, X., Gao, S., Qian, M., Yang, N., Xu, Y., Chen, M. Plant Sample Preparation for Nucleoside/Nucleotide Content Measurement with An HPLC-MS/MS. J. Vis. Exp. (168), e61956, doi:10.3791/61956 (2021).

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