Заводская пробоподготовка для измерения содержания нуклеозидов/нуклеотидов с помощью ВЭЖХ-MS/MS
Summary
Здесь описан точный и воспроизводимый метод количественного определения in vivo нуклеозидов/нуклеотидов в растениях. Этот метод использует ВЭЖХ-МС/МС.
Abstract
Нуклеозиды / нуклеотиды являются строительными блоками нуклеиновых кислот, частей косубстратов и коферментов, клеточных сигнальных молекул и энергоносителей, которые участвуют во многих клеточных действиях. Здесь мы описываем быстрый и надежный метод абсолютной квалификации содержания нуклеозидов/нуклеотидов в растениях. Вкратце, 100 мг гомогенизированного растительного материала экстрагировали с помощью 1 мл экстракционного буфера (метанол, ацетонитрил и вода в соотношении 2:2:1). Позже образец концентрировали пять раз в сублимационной сушилке, а затем вводили в ВЭЖХ-MS/MS. Нуклеотиды отделяли на пористой графитовой углеродной (PGC) колонке, а нуклеозиды отделяли на колонке C18. Массовые переходы каждого нуклеозида и нуклеотида контролировались масс-спектрометрией. Содержание нуклеозидов и нуклеотидов было количественно определено в сопоставлении с их внешними стандартами (ESTD). Поэтому, используя этот метод, исследователи могут легко количественно оценить нуклеозиды / нуклеотиды в разных растениях.
Introduction
Нуклеозиды / нуклеотиды являются центральными метаболическими компонентами во всех живых организмах, которые являются предшественниками нуклеиновых кислот и многих коферментов, таких как никотинамидадениндинуклеотид (NAD), и важны в синтезе макромолекул, таких как фосфолипиды, гликолипиды и полисахариды. Структурно нуклеозид содержит нуклеоосно, которое может быть аденином, гуанином, урацилом, цитозином или тимином, и сахарный мутик, который может представлять собой рибозу или дезоксирибозу1,2. Нуклеотиды имеют до трех фосфатных групп, связывающихся с 5-углеродным положением сахарного муля нуклеозидов3. Метаболизм нуклеотидов в растениях необходим для прорастания семян и роста листьев4,5,6. Чтобы лучше понять их физиологическую роль в развитии растений, следует установить методы абсолютной количественной оценки различных нуклеозидов/нуклеотидов in vivo.
Один из наиболее часто используемых подходов к измерению нуклеозидов /нуклеотидов использует высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ) в сочетании с ультрафиолетовым (UV-VIS) детектором4,7,8,9,10,11. В 2013 году, используя ВЭЖХ, Данке и Витте количественно оценили несколько типов нуклеозидов в Arabidopsis thaliana7. Они идентифицировали повышенное содержание гуанозина в мутанте, нацеленном на вставку Т-ДНК в гене гуанозиндезаминазы по сравнению с растением дикого типа. Другой пиримидин нуклеозид, цитидин, также был количественно обнаружен в растениях, использующих этот метод, что привелок идентификации гена 4 добросовестной цитидиндеаминазы. Однако, основанный на УФ-детекторе, этот метод не может легко отличить нуклеозиды, которые имеют сходные спектры и время удержания, например, гуанозин или ксантозин. Предел обнаружения метода ВЭЖХ относительно высок, поэтому его часто используют для измерения высокого содержания нуклеозидов in vivo, таких как цитидин, уридин и гуанозин.
Кроме того, газовая хроматография в сочетании с масс-спектрометрией (GC-MS) также может быть использована в измерении нуклеозидов. Извлекая из этого выгоду, Хаук и др. al. успешно обнаружены уридин и мочевая кислота, которая является последующим метаболитом нуклеозидного катаболического пути, в семенах A. thaliana12. Однако ГК обычно используется для разделения летучих соединений, но не подходит для термически лабильных веществ. Поэтому жидкостная хроматография, связанная с масс-спектрометрией (LC-MS/MS), вероятно, является более подходящим и точным аналитическим методом для идентификации, разделения и количественного определения нуклеозидов/нуклеотидов in vivo13,14. В нескольких предыдущих исследованиях сообщалось, что колонка HILIC может быть использована для разделения нуклеозидов и нуклеотидов15,16 и изотопно меченые внутренние стандарты были использованы для количественной оценки соединения17. Тем не менее, оба компонента являются относительно дорогими, особенно коммерческие стандарты, маркированные изотопами. Здесь мы сообщаем об экономически применимом подходе LC-MS/MS для измерения нуклеозидов/нуклеотидов. Этот метод уже успешно используется для количественного определения различных нуклеозидов/нуклеотидов, включая АТФ,N6-метил-АМФ,АМФ, GMP, уридин, цитидин и псевдоуридин1,5,6,18,у растений и дрозофилы. Более того, метод, о который мы здесь сообщаем, может быть использован и в других организмах.
Protocol
Representative Results
Discussion
Организмы содержат различные нуклеозиды/нуклеотиды, в том числе канонические и аберрантные. Однако происхождение и метаболические конечные точки их, особенно модифицированных нуклеозидов, все еще неясны. Кроме того, современное понимание функции и гомеостаза метаболизма нуклеозидов…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была финансово поддержана Фондами фундаментальных исследований для центральных университетов (KJQN202060), Национальным фондом естественных наук Китая (31900907), Фондом естественных наук провинции Цзянсу (BK20190528), Международным центром генной инженерии и биотехнологии (CRP / CHN20-04_EC) до M.C. и Фондами фундаментальных исследований для центральных университетов (LGZD202004) до X.L.
Materials
| acetonitrile | Sigma-Aldrich | 1000291000 | |
| adenosine | Sigma-Aldrich | A9251-1G | |
| ammonium acetate | Sigma-Aldrich | 73594-100G-F | |
| AMP | Sigma-Aldrich | 01930-5G | |
| CMP | Sigma-Aldrich | C1006-500MG | |
| cytidine | Sigma-Aldrich | C122106-1G | |
| GMP | Sigma-Aldrich | G8377-500MG | |
| guanosine | Sigma-Aldrich | G6752-1G | |
| Hypercarb column | Thermo Fisher Scientific GmbH | 35005-054630 | |
| IMP | Sigma-Aldrich | 57510-5G | |
| inosine | Sigma-Aldrich | I4125-1G | |
| methanol | Sigma-Aldrich | 34860-1L-R | |
| N1-methyladenosine | Carbosynth | NM03697 | |
| O6-methylguanosine | Carbosynth | NM02922 | |
| Murashige and Skoog Medium | Duchefa Biochemie | M0255.005 | |
| Polaris 5 C18A column | Agilent Technologies | A2000050X046 | |
| pseudouridine | Carbosynth | NP11297 | |
| UMP | Sigma-Aldrich | U6375-1G | |
| uridine | Sigma-Aldrich | U3750-1G |
Referenzen
- Liu, B., Winkler, F., Herde, M., Witte, C. -. P., Großhans, J. A link between deoxyribonucleotide metabolites and embryonic cell-cycle control. Current Biology. 29 (7), 1187-1192 (2019).
- Zrenner, R., Stitt, M., Sonnewald, U., Boldt, R. Pyrimidine and purine biosynthesis and degradation in plants. Annual Review of Plant Biology. 57, 805-836 (2006).
- Witte, C. -. P., Herde, M. Nucleotide metabolism in plants. Plant Physiology. 182 (1), 63-78 (2020).
- Chen, M., Herde, M., Witte, C. -. P. Of the nine cytidine deaminase-like genes in Arabidopsis, eight are pseudogenes and only one is required to maintain pyrimidine homeostasis in vivo. Plant Physiology. 171 (2), 799-809 (2016).
- Chen, M., et al. m6A RNA degradation products are catabolized by an evolutionarily conserved N6-methyl-AMP deaminase in plant and mammalian cells. The Plant Cell. 30 (7), 1511-1522 (2018).
- Chen, M., Witte, C. -. P. A kinase and a glycosylase catabolize pseudouridine in the peroxisome to prevent toxic pseudouridine monophosphate accumulation. The Plant Cell. 32 (3), 722-739 (2020).
- Dahncke, K., Witte, C. -. P. Plant purine nucleoside catabolism employs a guanosine deaminase required for the generation of xanthosine in Arabidopsis. The Plant Cell. 25 (10), (2013).
- Jung, B., et al. Uridine-ribohydrolase is a key regulator in the uridine degradation pathway of Arabidopsis. The Plant Cell. 21 (3), 876-891 (2009).
- Jung, B., Hoffmann, C., Moehlmann, T. Arabidopsis nucleoside hydrolases involved in intracellular and extracellular degradation of purines. Plant Journal. 65 (5), 703-711 (2011).
- Riegler, H., Geserick, C., Zrenner, R. Arabidopsis thaliana nucleosidase mutants provide new insights into nucleoside degradation. New Phytologist. 191 (2), 349-359 (2011).
- Zrenner, R., et al. A functional analysis of the pyrimidine catabolic pathway in Arabidopsis. New Phytologist. 183 (1), 117-132 (2009).
- Hauck, O. K., et al. Uric acid accumulation in an Arabidopsis urate oxidase mutant impairs seedling establishment by blocking peroxisome maintenance. The Plant Cell. 26 (7), 3090-3100 (2014).
- Qu, C., et al. Comparative analysis of nucleosides, nucleobases, and amino acids in different parts of Angelicae Sinensis Radix by ultra high performance liquid chromatography coupled to triple quadrupole tandem mass spectrometry. Journal of Separation Science. 42 (6), 1122-1132 (2019).
- Zong, S. -. Y., et al. Fast simultaneous determination of 13 nucleosides and nucleobases in Cordyceps sinensis by UHPLC-ESI-MS/MS. Molecules. 20 (12), 21816-21825 (2015).
- Moravcová, D., et al. Separation of nucleobases, nucleosides, and nucleotides using two zwitterionic silica-based monolithic capillary columns coupled with tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography. A. 1373, 90-96 (2014).
- Guo, S., et al. Hydrophilic interaction ultra-high performance liquid chromatography coupled with triple quadrupole mass spectrometry for determination of nucleotides, nucleosides and nucleobases in Ziziphus plants. Journal of Chromatography. A. 1301, 147-155 (2013).
- Seifar, R. M., et al. Simultaneous quantification of free nucleotides in complex biological samples using ion pair reversed phase liquid chromatography isotope dilution tandem mass spectrometry. Analytical Biochemistry. 388 (2), 213-219 (2009).
- Baccolini, C., Witte, C. -. P. AMP and GMP catabolism in Arabidopsis converge on xanthosine, which is degraded by a nucleoside hydrolase heterocomplex. The Plant Cell. 31 (3), 734-751 (2019).
