Hjertet har lenge vært ansett for å være et post-mitotisk organ, men nyere bevis viser at kardiomyocytter fornyelse forekommer i voksen menneskelig hjerte på ca 1% per år¹. Imidlertid er disse lave frekvensene av kardiomycyttomsetning utilstrekkelig til å fylle det massive tapet av vev som oppstår etter skade. Et hjerte som har lidd en hjerteinfarkt vil miste rundt en milliard kardiomyocytter, ofte fungerer som et forspill til hjertesvikt og plutselig hjertedød^2,3. Med over 26 millioner mennesker rammet av hjertesvikt over hele verden, er det et udekket behov for terapeutiske midler som kan reversere skadene påført av hjertesykdom⁴.

For å bygge bro over dette gapet i terapeutiske midler, har forskere begynt å undersøke evolusjonært bevarte mekanismer som ligger til grunn for endogen regenerering etter skade. En modell for å studere pattedyr hjerteregenerering er neonatal musen. I løpet av uken etter fødselen har nyfødte mus en robust regenerativ respons etter hjerteskade⁵. Vi har tidligere vist at neonatalmus kan regenerere sitt hjerte via kardiomycyttspredning etter en apikal reseksjon⁵. Selv om denne teknikken kan fremkalle hjerteregenerering i nyfødte, mangler operasjonen klinisk relevans for menneskelige hjerteskader. For å etterligne en menneskelig skade i neonatal musemodell, har vi utviklet en teknikk for å indusere et hjerteinfarkt gjennom en koronarokklusjon⁶. Denne teknikken krever kirurgisk ligation av venstre geerior synkende arterie (LAD), som er ansvarlig for å levere 40%-50% av blodet til venstre ventrikulær myokardiet^6,7. Dermed resulterer operasjonen i en infarkt som påvirker en betydelig del av venstre ventrikulær vegg. Denne skaden på myokardiet vil stimulere kardiomycytt spredning og hjerte regenerering i nyfødte⁵.

Koronararterienokklusjonkirurgi gir en svært reproduserbar og direkte translasjonell metode for å avdekke den indre driften av hjerteregenerering. Neonatal kirurgi paralleller koronar aterosklerose i det menneskelige hjerte, hvor akkumulering av plakk innenfor de indre veggene i arteriene kan forårsake en okklusjon og påfølgende hjerteinfarkt⁸. På grunn av et tomrom i terapeutiske behandlinger for hjertesviktpasienter, er en okklusjon i LAD forbundet med dødelighet som når opp til 26% innen et år etter skade⁹, og følgelig har blitt kalt “enkemakeren”. Fremskritt i terapeutiske midler krever en modell som nøyaktig gjenspeiler de komplekse fysiologiske og patologiske effektene av hjerteskade. Vår kirurgiske protokoll for neonatal mus hjerteskade gir en plattform som gjør det mulig for forskere å undersøke molekylære og cellulære signaler som signaliserer pattedyr hjerteregenerering etter skade.

Nyere forskning fremhever det dynamiske forholdet mellom det ekstracellulære miljøet og prolifererende kardiomyocytter. For eksempel kan det postnatale regenerative vinduet forlenges ved å redusere stivheten til den ekstracellulære matrisen rundt hjertet¹⁰. Biomaterialer fra neonatal extracellulær matrise kan også fremme hjerteregenerering hos voksne pattedyrhjerter etter hjerteskade¹¹. Også medkardiomyocytter proliferasjon er en angiogen respons^12,13; sikkerhet arterie dannelse unik for regenererende hjertet av neonatal musen ble vist å være avgjørende for å stimulere hjerte regenerering¹². Videre har vårt laboratorium vist at nervesignalering regulerer kardiomycyttspredning og hjerteregenerering via modulering av vekstfaktornivåer, samt den inflammatoriske responsen etter skade¹⁴. Disse funnene understreker behovet for å spore ikke-myocytter cellepopulasjoner som svar på hjerteskade. For å oppnå dette målet har vi benyttet oss av Cre-lox rekombinasjonssystemet i transgene muslinjer for å innlemme konstitutivt eller betinget uttrykk for fluorescerende reporterproteiner for avstamningssporing. Videre kan vi bruke avanserte metoder for å bestemme klonal ekspansjonsmønster med Rainbow-muselinjen, som er avhengig av stokastisk uttrykk for de Cre-avhengige, multifargede fluorescerende journalistene for å bestemme klonal utvidelse av målrettede cellepopulasjoner¹⁵. Å bruke avstamning sporing med neonatal koronar okklusjon kirurgi er et kraftig verktøy for dissekering intrikate cellulære mekanismer for hjerteregenerering.

Sporing av avstamning av fluorescerende merkede celler med tredimensjonale (3D) hele organavbildning er vanskelig å oppnå ved hjelp av tradisjonell snitting og rekonstruksjonsteknikk – spesielt når cellepopulasjoner er skjøre, for eksempel nervefibre eller blodkar. Mens direkte hele mount avbildning av orgelet ved optisk snitting kan fange overfladiske cellepopulasjoner, strukturer som bor dypt inne i vevet forblir utilgjengelig. For å omgå disse barrierene, vev clearing teknikker har blitt utviklet for å redusere opasitet av hele organvev. Nylig har det blitt gjort betydelige fremskritt for å fjerne lipid-utvekslet akrylamid-hybridisert Rigid Imaging kompatibel Tissue hYdrogel (CLARITY)-baserte metoder, som fjerner fast vev via lipid utvinning¹⁶. Det iverksettes også tiltak for å homogenisere brytningsindeksen og deretter redusere lysspredning mens bildebehandling¹⁷. En slik metode er aktiv CLARITY, som fremskynder lipidnedbrytning ved hjelp av elektroforese for å trenge inn i vaskemiddelet gjennom hele vevet¹⁸. Selv om effektiv, krever denne vevsfjerningsmetoden dyrt utstyr og kan forårsake vevsskade, noe som gjør tilnærmingen uforenlig med skjøre cellepopulasjoner som hjertenervene¹⁹. Dermed bruker vi den passive CLARITY-tilnærmingen, som er avhengig av varme for å forsiktig lette vaskemiddelpenetrasjon, og hjelper derfor til oppbevaring av intrikate cellestrukturer^20,,21.

Passiv KLARHET er vanligvis antatt å være mindre effektiv enn aktiv CLARITY¹⁸, da teknikken ofte ledsages av to store hindringer: manglende evne til å fjerne hele organdybden og den omfattende tiden som kreves for å fjerne voksent vev. Vår passive CLARITY-tilnærming overvinner begge disse barrierene med en fremskyndet clearingprosess som er i stand til å fullstendig rydde neonatal og voksent hjertevev. Vår passive CLARITY vevingsteknikk har nådd en effektivitet som tillater visualisering av en rekke hjertecellepopulasjoner, inkludert sjeldne populasjoner distribuert over hele det voksne hjertet. Når det ryddet hjertet er avbildet med konfokal mikroskopi, kan arkitekturen av cellespesifikk mønster under utvikling, sykdom og regenerering belyses.