Capturando a resposta de lesão cardíaca de populações de células-alvo através de imagens tridimensionais do coração limpo

O coração tem sido considerado por muito tempo como um órgão pós-mitótico, mas evidências recentes demonstram que a renovação dos cardiomiócitos ocorre no coração humano adulto em cerca de 1% ao ano¹. No entanto, essas baixas taxas de rotatividade de cardiomiócitos são insuficientes para repor a perda maciça de tecido que ocorre após a lesão. Um coração que sofreu um infarto do miocárdio perderá cerca de um bilhão de cardiomiócitos, muitas vezes servindo como prelúdio para insuficiência cardíaca e morte cardíaca súbita^2,3. Com mais de 26 milhões de pessoas afetadas pela insuficiência cardíaca em todo o mundo, há uma necessidade não atendida de terapêutica que pode reverter os danos infligidos por doenças cardíacas⁴.

A fim de preencher essa lacuna na terapêutica, os cientistas começaram a investigar mecanismos evolutivamente conservados que sustentam a regeneração endógena após a lesão. Um modelo para estudar a regeneração cardíaca de mamíferos é o camundongo neonatal. Na semana seguinte ao nascimento, os camundongos neonatais têm uma resposta regenerativa robusta após danos cardíacos⁵. Já demonstramos anteriormente que camundongos neonatais podem regenerar seu coração através da proliferação de cardiomiócitos após uma ressecção apical⁵. Embora essa técnica possa evocar a regeneração cardíaca nos recém-nascidos, a cirurgia carece de relevância clínica para lesões cardíacas humanas. Para imitar uma lesão humana no modelo de camundongos neonatais, desenvolvemos uma técnica para induzir um infarto do miocárdio através de uma oclusão da artéria coronária⁶. Esta técnica requer ligadura cirúrgica da artéria descendente anterior esquerda (LAD), responsável por fornecer 40%-50% do sangue para o miocárdio ventricular esquerdo^6,7. Assim, a cirurgia resulta em um infarto que impacta uma parcela significativa da parede ventricular esquerda. Este dano ao miocárdio estimulará a proliferação de cardiomiócitos e a regeneração cardíaca em recém-nascidos⁵.

A cirurgia de oclusão da artéria coronária fornece um método altamente reprodutível e diretamente translacional para descobrir o funcionamento interno da regeneração cardíaca. A cirurgia neonatal faz um paralelo com a aterosclerose da artéria coronária no coração humano, onde o acúmulo de placa dentro das paredes internas das artérias pode causar uma oclusão e posterior infarto do miocárdio⁸. Devido a um vazio nos tratamentos terapêuticos para pacientes com insuficiência cardíaca, uma oclusão no LAD está associada a taxas de mortalidade que chegam a 26% dentro de um ano após a lesão⁹, e consequentemente tem sido chamada de “fazedora de viúvas”. Os avanços terapêuticos requerem um modelo que reflita com precisão os complexos efeitos fisiológicos e patológicos da lesão cardíaca. Nosso protocolo cirúrgico para lesão cardíaca de camundongos neonatais fornece uma plataforma que permite aos pesquisadores investigar as pistas moleculares e celulares que sinalizam a regeneração cardíaca dos mamíferos após a lesão.

Pesquisas recentes destacam a relação dinâmica entre o ambiente extracelular e a proliferação de cardiomiócitos. Por exemplo, a janela regenerativa pós-natal pode ser estendida diminuindo a rigidez da matriz extracelular ao redor do coração¹⁰. Biomateriais da matriz extracelular neonatal também podem promover a regeneração cardíaca em corações de mamíferos adultos após lesão cardíaca¹¹. Também acompanhando a proliferação de cardiomiócitos é uma resposta angiogênica^12,13; a formação da artéria colateral única ao coração regenerador do camundongo neonatal mostrou-se essencial para estimular a regeneração cardíaca¹². Além disso, nosso laboratório demonstrou que a sinalização nervosa regula a proliferação de cardiomiócitos e a regeneração cardíaca via modulação dos níveis dos fatores de crescimento, bem como a resposta inflamatória após a lesão¹⁴. Esses achados enfatizam a necessidade de traçar populações de células não miócitos em resposta a lesões cardíacas. Para atingir esse objetivo, aproveitamos o sistema de recombinação Cre-lox em linhas transgênicas de camundongos para incorporar a expressão constitutiva ou condicional de proteínas fluorescentes de repórteres para rastreamento de linhagem. Além disso, podemos usar métodos avançados para determinar a padronização da expansão clonal com a linha de mouses Rainbow, que se baseia na expressão estocástica dos repórteres fluorescentes de cor multi-cor dependentes do Cre para determinar a expansão clonal das populações de células-alvo¹⁵. A utilização de rastreamento de linhagem com a cirurgia de oclusão da artéria coronária neonatal é uma poderosa ferramenta para dissecar os intrincados mecanismos celulares de regeneração cardíaca.

O rastreamento da linhagem de células fluorescentes rotuladas com imagens de órgãos tridimensionais (3D) é difícil de alcançar usando a técnica tradicional de secção e reconstrução – especialmente quando as populações celulares são frágeis, como fibras nervosas ou vasos sanguíneos. Enquanto a imagem direta do órgão por secção óptica pode capturar populações celulares superficiais, estruturas que residem profundamente dentro do tecido permanecem inacessíveis. Para contornar essas barreiras, técnicas de limpeza de tecidos foram desenvolvidas para reduzir a opacidade de tecidos de órgãos inteiros. Recentemente, avanços significativos foram feitos para os métodos de tecido rígido hibridizado de Acrilamida com acrilamida da Clear Lipide- hibridizado de imagem rígida hYdrogel (CLARITY), que limpam o tecido fixo através da extração lipídica¹⁶. Medidas também são tomadas para homogeneizar o índice de refração e, posteriormente, reduzir a dispersão de luz durante a imagem¹⁷. Um desses métodos é o CLARITY ativo, que acelera a decomposição lipídica usando eletroforese para penetrar o detergente em todo o tecido¹⁸. Embora eficaz, este método de limpeza de tecidos requer equipamentos caros e pode causar danos teciduais, tornando a abordagem incompatível com populações celulares frágeis, como os nervos cardíacos¹⁹. Assim, utilizamos a abordagem passiva CLARITY, que conta com o calor para facilitar suavemente a penetração de detergentes, auxiliando, portanto, na retenção de estruturas celulares intrincadas^20,21.

A CLARIDADE Passiva é tipicamente considerada menos eficiente do que a CLARIDADE ativa^18,pois a técnica é frequentemente acompanhada por dois grandes obstáculos: a incapacidade de limpar toda a profundidade do órgão e a extensa quantidade de tempo necessária para limpar tecidos adultos. Nossa abordagem passiva CLARITY supera ambas as barreiras com um processo de limpeza acelerada que é capaz de limpar totalmente o tecido cardíaco neonatal e adulto. Nossa técnica passiva de limpeza de tecidos CLARITY alcançou uma eficiência que permite a visualização de uma variedade de populações de células cardíacas, incluindo populações raras distribuídas por todo o coração adulto. Quando o coração limpo é imagemdo com microscopia confocal, a arquitetura da padronização específica da célula durante o desenvolvimento, doença e regeneração pode ser iluminada.