Temizlenmiş Kalp Üç Boyutlu Görüntüleme ile Hedefhücre Popülasyonlarının Kardiyak Yaralanma Yanıtının Yakalanması

Kalp uzun bir post-mitotik organ olarak kabul edilmiştir, henüz son kanıtlar kardiyomiyosit yenilenmesi yılda yaklaşık% 1 yetişkin insan kalbinde meydana geldiğini göstermektedir¹. Ancak, kardiyomiyosit ciro bu düşük oranları yaralanma sonrasında meydana gelen doku büyük kaybı doldurmak için yetersizdir. Bir miyokard enfarktüsü acı bir kalp genellikle kalp yetmezliği ve ani kardiyak ölüm^2,,3bir prelüd olarak hizmet veren, bir milyar kardiyomiyosit civarında kaybedersiniz . Dünya çapında kalp yetmezliğinden etkilenen 26 milyondan fazla insan ile, kalp hastalığı⁴tarafından neden olduğu zararları tersine çevirebilir terapötik için karşılanmamış bir ihtiyaç vardır.

Terapötik ler arasındaki bu boşluğu kapatmak için bilim adamları, yaralanma sonrası endojen yenilenmenin altında yatan evrimsel olarak korunmuş mekanizmaları araştırmaya başladılar. Memeli kardiyak rejenerasyonu üzerinde çalışmak için bir model yenidoğan faresidir. Doğumu takip eden hafta içinde, yenidoğan farelerkardiyak hasarı takiben sağlam bir rejeneratif yanıta sahiptir⁵. Daha önce neonatal farelerin apikal rezeksiyon⁵sonrasında kardiyomiyosit proliferasyonu ile kalplerini yenileyebildiklerini göstermiştir. Bu teknik, yenini kardiyak rejenerasyon uyandırmak rağmen, cerrahi insan kalp yaralanmaları için klinik alaka yoksundur. Neonatal fare modelinde bir insan yaralanması taklit etmek için, bir koroner arter tıkanıklığı ile miyokard enfarktüsü neden bir teknik geliştirdik⁶. Bu teknik sol ventrikül miyokardiyum^6,,7kan% 40-50 teslim sorumludur sol anterior inen arter (LAD), cerrahi ligasyon gerektirir. Böylece, cerrahi sol ventrikül duvarının önemli bir bölümünü etkileyen bir enfarktüs sonuçları. Miyokardindeki bu hasar kardiyomiyosit proliferasyonlarını ve kalp yenilenmesini teşvik edecektir^5.

Koroner arter oklüzyon cerrahisi kardiyak rejenerasyon iç işleyişini ortaya çıkarmak için son derece tekrarlanabilir ve doğrudan çeviriyöntemi sağlar. Yenidoğan cerrahisi insan kalbinde koroner arter ateroskleroz paralellikler, arterlerin iç duvarları içinde plak birikimi bir oklüzyon ve sonraki miyokard enfarktüsü neden olabilir⁸. Kalp yetmezliği hastaları için terapötik tedavilerde bir boşluk nedeniyle, LAD bir tıkanıklık yaralanma⁹aşağıdaki bir yıl içinde% 26’ya ulaşan mortalite oranları ile ilişkilidir , ve sonuç olarak “dul yapıcı” olarak adlandırılmıştır. Terapötik gelişmeler doğru kardiyak yaralanma karmaşık fizyolojik ve patolojik etkilerini yansıtan bir model gerektirir. Yenidoğan fare kardiyak yaralanması için cerrahi protokolümüz, araştırmacıların yaralanma sonrası memeli kalp yenilenmesini işaret eden moleküler ve hücresel ipuçlarını araştırmalarını sağlayan bir platform sağlar.

Son araştırmalar hücre dışı ortam ve kardiyomiyositler çoğalan arasındaki dinamik ilişkiyi vurgulamaktadır. Örneğin, postnatal rejeneratif pencere kalbi çevreleyen hücre dışı matriks sertliği azaltarak uzatılabilir¹⁰. Yenidoğan ekstrasellüler matris biyomalzemeler de kardiyak yaralanma¹¹aşağıdaki yetişkin memeli kalplerde kalp rejenerasyonu teşvik edebilir. Ayrıca kardiyomiyosit proliferasyonu eşlik eden bir anjiyojenik yanıt^12,13; yenidoğan farenin rejeneratif kalbine özgü kollateral arter oluşumukardiyak rejenerasyonu teşvik etmek için gerekli olduğu gösterilmiştir¹². Ayrıca, bizim laboratuvar sinir sinyalizasyonu kardiyomiyosit proliferasyon ve büyüme faktörü düzeyleri modülasyonu yoluyla kalp rejenerasyon düzenler göstermiştir, yanı sıra yaralanma sonrası inflamatuar yanıt¹⁴. Bu bulgular kardiyak yaralanmaya yanıt olarak miyosit dışı hücre popülasyonlarının izlenmesi gereğini vurgulamaktadır. Bu amaca ulaşmak için, transgenik fare hatlarındaki Cre-lox rekombinasyon sisteminden yararlanarak floresan muhabir proteinlerin kurucu veya koşullu ifadesini soy takibi için birleştirdik. Ayrıca, hedeflenen hücre popülasyonlarının klonal genişlemesini belirlemek için Cre bağımlı, çok renkli floresan muhabirlerin stokastik ifadesine dayanan Rainbow fare çizgisi ile klonal genişleme desenlerini belirlemek için gelişmiş yöntemler kullanabiliriz¹⁵. Neonatal koroner arter oklüzyonu cerrahisi ile soy takibi nin alınması, kardiyak rejenerasyonun karmaşık hücresel mekanizmalarını incelemek için güçlü bir araçtır.

Floresan etiketli hücrelerin soyunu üç boyutlu (3D) tüm organ görüntülemesi ile izlemek geleneksel kesitleme ve rekonstrüksiyon tekniği kullanılarak elde etmek zordur – özellikle hücre popülasyonları kırılgan olduğunda, sinir lifleri veya kan damarları gibi. Optik kesitile organın doğrudan tam montaj görüntüleme yüzeysel hücre popülasyonları yakalayabilir iken, doku içinde derin bulunan yapılar erişilemez kalır. Bu engelleri aşmak için, doku temizleme teknikleri tüm organ dokularının opaklık azaltmak için geliştirilmiştir. Son zamanlarda, önemli gelişmeler Clear Lipid-exchanged Akrilamid-hibrid Rijit Görüntüleme uyumlu Doku hYdrogel (CLARITY) tabanlı yöntemler, hangi lipid ekstraksiyon u geçerek sabit doku temiz¹⁶yapılmıştır . Kırılma indisi homojenize etmek ve daha sonra^17’yigörüntülerken ışık saçılımını azaltmak için de adımlar atılır. Böyle bir yöntem aktif CLARITY, hangi doku¹⁸boyunca deterjan nüfuz elektroforez kullanarak lipid ayrışmasını hızlandırır. Etkili olmasına rağmen, Bu doku temizleme yöntemi pahalı ekipman gerektirir ve doku hasarına neden olabilir, yaklaşım kardiyak sinirler gibi kırılgan hücre popülasyonları ile uyumsuz hale¹⁹. Böylece, biz yavaşça deterjan penetrasyon kolaylaştırmak için ısı dayanır pasif CLARITY yaklaşımı, istihdam, bu nedenle karmaşık hücre yapılarının tutulmasına yardımcı^20,21.

Pasif BERRAKLIK genellikle aktif CLARITY¹⁸daha az verimli olduğu düşünülmektedir , teknik genellikle iki büyük engeller eşlik ettiği gibi: yetersizlik tüm organ derinliği temizlemek için ve yetişkin dokuları temizlemek için gerekli zaman geniş miktarda. Pasif CLARITY yaklaşımımız, yenidoğan ve erişkin kalp dokusunu tamamen temizleyebilecek hızlı bir temizleme işlemi yle bu engellerin her ikisini de aşar. Pasif CLARITY doku temizleme tekniğimiz, erişkin kalbe dağılmış nadir popülasyonlar da dahil olmak üzere çeşitli kardiyak hücre popülasyonlarının görüntülenmesine izin veren bir verimliliğe ulaşmıştır. Temizlenmiş kalp konfokal mikroskopi ile görüntülendiğinde, gelişim, hastalık ve rejenerasyon sırasında hücreye özgü desenleme mimarisi aydınlatılabilir.