Catturare la risposta alle lesioni cardiache delle popolazioni cellulari mirate tramite l'imaging tridimensionale del cuore autorizzato

Il cuore è stato a lungo considerato un organo post-mitotico, ma prove recenti dimostrano che il rinnovamento cardiomiocito si verifica nel cuore umano adulto a circa 1% all’anno¹. Tuttavia, questi bassi tassi di avvicendamento cardiomiocito sono insufficienti per ricostituire la massiccia perdita di tessuto che si verifica dopo lesioni. Un cuore che ha subito un infarto miocardico perderà circa un miliardo di cardiomiociti, spesso servendo come preludio all’insufficienza cardiaca e morte cardiaca improvvisa^2,3. Con oltre 26 milioni di persone affette da insufficienza cardiaca in tutto il mondo, c’è un bisogno insoddisfatto di terapie che possono invertire i danni inflitti da malattie cardiache⁴.

Al fine di colmare questa lacuna nelle terapie, gli scienziati hanno iniziato a studiare meccanismi evolutivamente conservati che sono alla base della rigenerazione endogena a seguito di lesioni. Un modello per studiare la rigenerazione cardiaca dei mammiferi è il topo neoooatale. Entro la settimana successiva alla nascita, i topi neonatali hanno una robusta risposta rigenerativa in seguito a danni cardiaci⁵. Abbiamo dimostrato in precedenza che i topi neotossici possono rigenerare il loro cuore attraverso la proliferazione cardiomiocite a seguito di una resezione apicale⁵. Anche se questa tecnica può evocare la rigenerazione cardiaca nei neonati, l’intervento chirurgico manca di rilevanza clinica per le lesioni cardiache umane. Al fine di imitare una lesione umana nel modello murino neonatale, abbiamo sviluppato una tecnica per indurre un infarto miocardico attraverso un’occlusione coronaria⁶. Questa tecnica richiede la legatura chirurgica dell’arteria discendente anteriore sinistra (LAD), che è responsabile della consegna 40-50% del sangue al miocardico ventricolare sinistro^6,7. Così, l’intervento chirurgico si traduce in un infarto che colpisce una parte significativa della parete ventricolare sinistra. Questo danno al miocardio stimolerà la proliferazione cardiomiocita e la rigenerazione del cuore nei neonati⁵.

La chirurgia dell’occlusione coronaria fornisce un metodo altamente riproducibile e direttamente traslazionale per scoprire il funzionamento interno della rigenerazione cardiaca. La chirurgia neonatale parallela all’aterosclerosi coronaria nel cuore umano, dove l’accumulo di placca all’interno delle pareti interne delle arterie può causare un’occlusione e la successiva infarto miocardico⁸. A causa di un vuoto nei trattamenti terapeutici per i pazienti con insufficienza cardiaca, un’occlusione nel LAD è associata a tassi di mortalità che raggiungono fino al 26% entro un anno dopo la lesione⁹, e di conseguenza è stato definito il “fabbricante di vedove”. I progressi nelle terapie richiedono un modello che rifletta con precisione i complessi effetti fisiologici e patologici delle lesioni cardiache. Il nostro protocollo chirurgico per lesioni cardiache del topo neooatale fornisce una piattaforma che consente ai ricercatori di studiare gli spunti molecolari e cellulari che segnalano la rigenerazione cardiaca dei mammiferi dopo l’infortunio.

Recenti ricerche evidenziano la relazione dinamica tra l’ambiente extracellulare e i cardiomiociti che proliferano. Ad esempio, la finestra rigenerativa postnatale può essere estesa diminuendo la rigidità della matrice extracellulare che circonda il cuore¹⁰. I biomateriali della matrice extracellulare neooooordinata possono anche promuovere la rigenerazione del cuore nei cuori dei mammiferi adulti dopo lesioni cardiache¹¹. Anche la proliferazione cardiomiocite di accompagnamento è una risposta angiogenica^12,13; formazione arteria collaterale unica per il cuore rigenerante del topo neonatale ha dimostrato di essere essenziale per stimolare la rigenerazione cardiaca¹². Inoltre, il nostro laboratorio ha dimostrato che la segnalazione del nervo regola la proliferazione cardiomiocita e la rigenerazione del cuore attraverso la modulazione dei livelli dei fattori di crescita, così come la risposta infiammatoria a seguito di lesioni¹⁴. Questi risultati sottolineano la necessità di tracciare le popolazioni di cellule non miocite in risposta a lesioni cardiache. Per raggiungere questo obiettivo, abbiamo sfruttato il sistema di ricombinazione Cre-lox in linee di topi transgenici per incorporare l’espressione coniugale o condizionale di proteine reporterfluescenti per la tracciatura del lignaggio. Inoltre, possiamo usare metodi avanzati per determinare il pattern di espansione clonale con la linea del mouse Arcobaleno, che si basa sull’espressione stocastica dei reporter fluorescenti multicolore dipendenti da Cre per determinare l’espansione clonale delle popolazioni di cellule mirate¹⁵. L’utilizzo del tracciamento del lignaggio con la chirurgia occlusione coronaria neonatale è un potente strumento per sezionare gli intricati meccanismi cellulari della rigenerazione cardiaca.

Monitorare il lignaggio delle cellule etichettate fluorescentmente con immagini di organi interi tridimensionali (3D) è difficile da ottenere utilizzando la tecnica tradizionale di sezionamento e ricostruzione, soprattutto quando le popolazioni di cellule sono fragili, come le fibre nervose o i vasi sanguigni. Mentre l’imaging diretto dell’intero montaggio dell’organo mediante sezionamento ottico può catturare le popolazioni di cellule superficiali, le strutture che risiedono in profondità all’interno del tessuto rimangono inaccessibili. Per aggirare queste barriere, sono state sviluppate tecniche di compensazione dei tessuti per ridurre l’opacità di interi tessuti dell’organo. Recentemente, sono stati fatti progressi significativi per i metodi basati su acdovesione compatibile con Acrylamide- Rigid Imaging compatibile Con Privo HYdrogel (CLARITY), che cancellano il tessuto fisso tramite estrazione lipidica¹⁶. Vengono inoltre adottate misure per omogeneizzare l’indice di rifrazione e successivamente ridurre la dispersione della luce durante l’imaging¹⁷. Uno di questi metodi è CLARITY attivo, che accelera la decomposizione dei lipidi utilizzando l’elettroforesi per penetrare il detersivo in tutto il tessuto¹⁸. Anche se efficace, questo metodo di compensazione dei tessuti richiede attrezzature costose e può causare danni ai tessuti, rendendo l’approccio incompatibile con le popolazioni cellulari fragili come i nervi cardiaci¹⁹. Così, impieghiamo l’approccio passivo CLARITY, che si basa sul calore per facilitare delicatamente la penetrazione del detergente, aiutando quindi nella conservazione di strutture cellulari intricate^20,21.

Il CLARITY passivo è tipicamente pensato per essere meno efficiente di QUELLO attivo CLARITY¹⁸, in quanto la tecnica è spesso accompagnata da due ostacoli principali: l’incapacità di cancellare l’intera profondità dell’organo e l’ampia quantità di tempo necessaria per cancellare i tessuti adulti. Il nostro approccio passivo CLARITY supera entrambe queste barriere con un processo di compensazione accelerato che è in grado di eliminare completamente il tessuto cardiaco neooatale e adulto. La nostra tecnica passiva di compensazione dei tessuti CLARITY ha raggiunto un’efficienza che permette la visualizzazione di una varietà di popolazioni di cellule cardiache, tra cui popolazioni rare distribuite in tutto il cuore adulto. Quando il cuore sgomberato è immaginato con microscopia confocale, l’architettura di patterning specifici delle cellule durante lo sviluppo, la malattia e la rigenerazione può essere illuminata.