Bewertung der Lymphozytenmigration in einem Ex-Vivo-Transmigrationssystem

Diese ursprüngliche Transmigration-Methode wurde 1962 von Stephen Boyden im Journal of Experimental Medicine¹vorgestellt. Vieles von dem, was wir über Chemotaxis und Chemokinetik wissen, wäre ohne die Entwicklung der Boydenkammer nicht möglich. Vor der Entdeckung des ersten Chemokins im Jahr 1977 wurden Ex-vivo-Transmigrationssysteme verwendet, um mehr über Serumfaktoren zu erfahren, die zelluläre Bewegungen in Makrophagen festsetzen könnten, während die zelluläre Motilität in Neutrophilen verstärkt wird^1,2. Es wurde ein riesiger Wissensschatz in Bezug auf die Immunzellmigration entwickelt, und bis heute wurden 47 Chemokine mit 19 entsprechenden Rezeptoren^3,4entdeckt. Darüber hinaus haben viele Inhibitoren/Enhancer dieser Chemokin-Wege eine Entwicklung zu therapeutischen^Zwecken5^,6,7,8. Viele dieser Verbindungen wurden in ähnlichen Transmigrationskammern getestet, um direkte Wechselwirkungen zwischen den Verbindungen und immunzellige Reaktionsfähigkeit auf ein bestimmtes Chemokin zu verstehen⁹.

Transmigration, oder Diapedese, in entzündetes Gewebe ist ein wesentlicher Prozess für eine gesunde Entzündungsreaktion auf klare Infektion^10,11. Ein Boyden-Kammer-, Transmigrationssystem oder Transwell-Apparat besteht in der Regel aus zwei Kammern, die durch eine poröse Membran^1,12getrennt sind. Die untere Kammer hält am häufigsten Medien, die das Chemokin von Interesse enthalten, während Leukozyten in der oberen Kammer platziert werden. Die Größe der Pore in der Membran kann basierend auf der Größe der betreffenden Zelle ausgewählt werden. Für dieses Projekt haben wir eine poröse Membran von 3 m ausgewählt, da die Lymphzellen je nach Stadium der zellulären Entwicklung 7-20 m groß sind. Diese Porengröße stellt sicher, dass diese Zellen nicht passiv durch die Poren fallen, sondern dass sie aktiv als Reaktion auf den Chemokingradienten migrieren.

Der hauptvorteil dieses Protokolls ist seine Wirtschaftlichkeit. Die In-vivo-Transmigration ist schwierig, da sie eine umfassende Ausbildung im Umgang mit Tieren und in der Chirurgie erfordert und häufig eine hochleistungsfähige Mikroskopie erfordert, die einem Forscher nicht immer zur Verfügung steht. Kostengünstiges Screening von Verbindungen, von denen angenommen wird, dass sie die Transmigration verbessern oder hemmen, kann vor der In-vivo-Bildgebung durchgeführt werden. Da das Transmigrationssystem streng kontrolliert wird, können Zellen zunächst dem Transwell-Apparat zugesetzt werden, oder umgekehrt kann das Chemokin zuerst mit einem Chemokin-Inhibitor behandelt werden, dann mit Zellen, die dem Transwell-Apparat zugesetzt werden. Schließlich können Endothelzellen und/oder Kellermembranproteine 1-2 Tage vor dem Transmigrationsexperiment an der Unterseite des Transwell-Inserts zugesetzt werden, um die Beteiligung dieser Barrierezellen an der Chemokinetik zu verstehen. Auch diese Manipulationen des Systems bieten ein leistungsfähiges Mittel, um wichtige Informationen über die Wirksamkeit einer bestimmten Verbindung im Vorfeld komplizierterer In-vivo-Studien zu bestimmen.

Die Verwendung eines Transmigrationskammersystems ist eine effektive Möglichkeit, die Lymphozytenmobilität unter verschiedenen In-vivo- und In-vitro-Bedingungen^12,13,14zu bewerten. Hierin beschreiben wir eine optimierte Methode zur Beurteilung der Ex-vivo-Lymphozytenreaktion auf Chemokine in einer Transmigrationskammer. In diesem Beispielexperiment wurden CD4⁺ T-Zellen und angeborene Lymphzellen der Gruppe 2 (ILC2) nach der OVA-Allergen-Exposition von männlichen und weiblichen BALB/c-Mäusen isoliert. Es wurde die Hypothese erstellt, dass CCR4⁺ CD45⁺ Lineage- (LIN-) ILC2 von allergenbekämpften Mäusen effizienter in Richtung CCL17 und CCL22 migrieren würde als CCR4⁺ CD4⁺ T-Helferzellen. CCL17 und CCL22 sind Chemokine, die häufig von dendritischen Zellen und Makrophagen des M2 (allergischen) Phänotyps unter anderen Zellen, in Allergie^15,16produziert werden. CCL17 und CCL22 können als Biomarker allergischer Entzündungen betrachtet werden, da sie bei Atemwegsexazerbationen^16,17,18leicht in der Lunge nachgewiesen werden können. Wichtig ist, dass die CCR4-Expression im Vergleich zu unbehandelten Kontrollen erhöht ist, wie aus bioinformatischen Daten hervorgeht, die aus ILC2 gewonnen wurden, das von Hausstaubmilben behandelten Tieren isoliert wurde, und ähnlich ILC2 von naiven Tieren, die ex vivo mit IL-33 behandelt wurden ( allergenförderndes angeborenes Zytokin) upreguliert CCR4^19,20. Darüber hinaus ist CCR4 mRNA nach Daten für ILC2 in der Datenbank des Immunologischen Genomprojekts (www.immgen.org) in diesen angeborenen Immunzellen stark exprimiert. Bis heute ist wenig über den Handel mit ILC2 in Gewebe bekannt, aber es ist wahrscheinlich, dass die ILC2- und CD4⁺ T-Zellen ähnliche Chemokine und Rezeptoren für Chemotaxis und Chemokinetik verwenden, da sie ähnliche Transkriptionsfaktoren und Rezeptoren ausdrücken. So verglichen wir CCL17 versus CCL22 Reaktionsfähigkeit, von ILC2 und CD4⁺ T Lymphozyten, von männlichen und weiblichen, OVA-herausgeforderten Tieren.