Beoordeling van de lymfocyten migratie in een ex vivo-Transmigratiesysteem

Deze oorspronkelijke transmigratie methode werd gepresenteerd door Stephen Boyden in 1962 in het tijdschrift van experimentele geneeskunde¹. Veel van wat we weten over chemotaxis en chemokinetica zou niet mogelijk zijn zonder de ontwikkeling van de Boyden kamer. Voorafgaand aan de ontdekking van de eerste Chemokine in 1977, werden ex vivo-transmigratie systemen gebruikt om te leren over serum factoren die de cellulaire beweging in macrofagen konden arresteren terwijl de cellulaire beweeglijkheid in neutrofielen^1,2werd verg^root. Een enorme rijkdom aan kennis is ontwikkeld met betrekking tot de immuuncelmigratie, en tot op heden, 47 chemokines zijn nu ontdekt met 19 overeenkomstige receptoren^3,4. Bovendien, menigten van remmers/versterkers van deze Chemokine trajecten hebben ondergaan ontwikkeling voor therapeutische doeleinden^5,6,7,8. Veel van deze verbindingen zijn getest in soortgelijke transmigratie kamers om te begrijpen van directe interacties tussen de verbindingen en immuuncellen responsiviteit op een bepaalde Chemokine⁹.

Transmigratie, of diapedesis, in ontstoken weefsel is een essentieel proces voor een gezonde ontstekingsreactie op heldere infectie^10,11. Een Boyden kamer, transmigratiesysteem of trans Well-apparaat bestaan over het algemeen uit twee kamers, gescheiden door een poreus membraan van^1,12. De onderste kamer bevat meestal media met de Chemokine van belang, terwijl leukocyten in de bovenste kamer worden geplaatst. De grootte van de porie in het membraan kan worden geselecteerd op basis van de grootte van de cel van belang. Voor dit project selecteerden we een 3 μm poreus membraan, omdat lymfoïde cellen 7-20 μm groot zijn, afhankelijk van het stadium van cellulaire ontwikkeling. Deze poriegrootte zorgt ervoor dat deze cellen niet passief door de poriën vallen, maar dat ze actief migreren naar aanleiding van de Chemokine gradiënt.

Het grote voordeel van dit protocol is de kosteneffectiviteit. In vivo is transmigratie moeilijk omdat het uitgebreide training vereist in dier hantering en chirurgie, en vaak gaat het om krachtige microscopie die niet altijd beschikbaar is voor een onderzoeker. Kostenefficiënte screening van verbindingen die bedoeld zijn om de transmigratie te verbeteren of te remmen, kan worden uitgevoerd voordat in vivo beeldvorming mogelijk is. Omdat het transmigratiesysteem strak wordt gecontroleerd, kunnen cellen aanvankelijk worden behandeld en vervolgens aan de trans well-apparatuur worden toegevoegd, of omgekeerd kan de Chemokine eerst met een Chemokine remmer worden behandeld, waarna cellen worden toegevoegd aan de trans well-apparatuur. Tot slot kunnen endotheelcellen en/of basaalmembraan proteïnen worden toegevoegd aan de onderzijde van de transwell insert 1-2 dagen voorafgaand aan het transmigratieexperiment om de betrokkenheid van deze barrière cellen in de chemokinetica te begrijpen. Nogmaals, deze manipulaties van het systeem bieden een krachtig middel om belangrijke informatie over de effectiviteit van een bepaalde compound te bepalen voor de ingewikkeldere in vivo studies.

Het gebruik van een systeem voor de transmigratie kamer is een effectieve manier om de lymfocyten mobiliteit te beoordelen onder verschillende in vivo en in vitro omstandigheden^12,13,14. Hierin beschrijven we een geoptimaliseerde methode voor het beoordelen van de responsiviteit van ex vivo lymfocyten op chemokinen in een transmigratiekamer. In dit voorbeeld experiment werden CD4⁺ T-cellen en groep 2 aangeboren lymfoïde cellen (ILC2) geïsoleerd van mannelijke en vrouwelijke, Balb/c-muizen na blootstelling aan OVA-allergenen. Er werd een hypothese gegenereerd dat CCR4⁺ CD45⁺ Lineage-(Lin-) ILC2 van met allergenen betwiste muizen efficiënter zou migreren naar CCL17 en CCL22 dan CCR4⁺ CD4⁺ T-helpercellen. CCL17 en CCL22 zijn chemokines die gewoonlijk worden geproduceerd door dendritische cellen en macrofagen van het m2 (allergische) fenotype, onder andere cellen, bij allergie^15,16. CCL17 en CCL22 kunnen worden gezien als biomarkers van allergische ontsteking, omdat ze gemakkelijk in de longen worden gedetecteerd tijdens luchtweg exacerbaties^16,17,18. Belangrijk is dat CCR4 expressie wordt verhoogd in vergelijking met onbehandelde controles, zoals blijkt uit bioinformatische gegevens die zijn gegenereerd uit ILC2 geïsoleerd van huisstofmijt behandelde dieren, en op dezelfde manier ILC2 van naïeve dieren behandeld ex vivo met IL-33 ( allergenen-bevorderend aangeboren cytokine) upregulates CCR4^19,20. Bovendien, volgens gegevens voor ILC2 in de database van het immunologische genoom project (www.immgen.org), CCR4 mRNA wordt sterk uitgedrukt in deze aangeboren immuuncellen. Tot op heden is er weinig bekend over de handel in ILC2 in weefsels, maar het is waarschijnlijk dat de ILC2 en CD4⁺ T-cellen soortgelijke chemokines en receptoren voor chemotaxis en chemokinetica gebruiken, omdat ze vergelijkbare transcriptiefactoren en receptoren uitdrukken. Zo vergeleken we CCL17 versus CCL22 responsiviteit, van ILC2 en CD4⁺ T-lymfocyten, van zowel mannelijke als vrouwelijke, met eicellen betwiste dieren.