Avaliação da migração do linfócito em um sistema de transmigração ex vivo

Este método original de transmigração foi apresentado por Stephen Boyden em 1962 no periódico de medicina experimental¹. Muito do que sabemos sobre quimiotaxia e quimiocinetics não seria possível sem o desenvolvimento da câmara de Boyden. Antes da descoberta da primeira quimiocina em 1977, os sistemas de transmigração ex vivo foram utilizados para aprender sobre os fatores séricos que poderiam prender o movimento celular em macrófagos, enquanto amplificavam a motilidade celular em neutrófilos^1,2. Uma riqueza maciça do conhecimento foi desenvolvida a respeito da migração imune da pilha, e até à data, 47 quimiocinas foram descobertas agora com 19 receptores correspondentes^3,4. Além disso, multidões de inibidores/potenciadores dessas vias de quimiocina passaram por desenvolvimento para fins terapêuticos^5,6,7,8. Muitos desses compostos foram testados em câmaras de transmigração semelhantes para compreender as interações diretas entre os compostos e a responsividade da célula imune a uma determinada quimiocina⁹.

A transmigração, ou diapedese, em tecido inflamado é um processo essencial para uma resposta inflamatória saudável à infecção clara^10,11. Uma câmara de Boyden, sistema de transmigração, ou aparelho transwell são geralmente compostas por duas câmaras separadas por uma membrana porosa^1,12. A câmara inferior mais frequentemente detém meios contendo a quimiocina de interesse, enquanto os leucócitos são colocados na câmara superior. O tamanho do poro na membrana pode ser selecionado com base no tamanho da célula de interesse. Para este projeto, selecionamos uma membrana porosa de 3 μm, pois as células linfóides têm 7-20 μm de tamanho, dependendo do estágio do desenvolvimento celular. Este tamanho do poro assegura-se de que estas pilhas não estejam caindo passivamente através dos poros, mas que estão migrando ativamente em resposta ao inclinação do quimiocina.

A principal vantagem deste protocolo é a sua rentabilidade. A transmigração in vivo é difícil porque requer treinamento extensivo em manuseio e cirurgia de animais, e muitas vezes envolve microscopia de alta potência que nem sempre está disponível para um pesquisador. A triagem econômica de compostos pensados para aprimorar ou inibir a transmigração pode ser realizada com antecedência na imagem latente in vivo. Como o sistema de transmigração é rigorosamente controlado, as células podem ser tratadas inicialmente, em seguida, adicionadas ao aparelho transwell, ou, vice-versa, a quimiocina pode ser tratada primeiro com um inibidor de quimiocina, em seguida, as células adicionadas ao aparelho transwell. Por fim, células endoteliais e/ou proteínas da membrana basal podem ser adicionadas ao fundo da pastilha transwell 1-2 dias antes do experimento de transmigração para compreender o envolvimento dessas células de barreira em quimiocinetics. Novamente, essas manipulações do sistema fornecem um meio poderoso de determinar informações importantes sobre a eficácia de um determinado composto antes de estudos mais complicados in vivo.

A utilização de um sistema de câmara de transmigração é uma forma efetiva de avaliar a mobilidade dos linfócitos várias condições in vivo e in vitro^12,13,14. Nisto, nós descrevemos um método aperfeiçoado para avaliar a compreensibilidade ex vivo do linfócito aos quimiocinas em uma câmara do transmigração. Neste experimento de exemplo, as células T CD4⁺ e as células linfóides inatas do grupo 2 (ILC2) foram isoladas de camundongos machos e fêmeas, Balb/c após exposição de óvulos-alérgeno. Uma hipótese foi gerada que CCR4⁺ CD45⁺ Lineage-(Lin-) ILC2 dos ratos alérgeno-desafiados migrariam mais EFICIENTEMENTE para CCL17 e CCL22 do que pilhas do ajudante de CCR4⁺ de CD4⁺ T. CCL17 e CCL22 são quimiocinas comumente produzidas por células dendríticas e macrófagos do fenótipo m2 (alérgico^{), entre}outras^{células, em}alergia^15,16. CCL17 e CCL22 podem ser pensados como biomarcadores de inflamação^{alérgica, pois}são prontamente detectados nos pulmões durante as exacerbações das vias aéreas^16,17,18. É importante ressaltar que a expressão CCR4 é elevada em comparação aos controles não tratados, como revelado em dados bioinformaticos gerados a partir de ILC2 isolados de animais tratados com ácaros da casa, e similarmente ILC2 de animais ingênuos tratados ex vivo com IL-33 ( cytokine inata de promoção do alérgeno) upregulates CCR4^,19. Além disso, de acordo com dados para ILC2 na base de dados do projeto do genoma imunológico (www.immgen.org), CCR4 mRNA é expressado altamente nestas pilhas imunes inata. Até o momento, pouco se sabe sobre o tráfico de ILC2 em tecidos, mas é provável que as células T de ILC2 e CD4⁺ usem quimiocinas e receptores semelhantes para quimiotaxia e quimiocinetics, pois expressam fatores e receptores de transcrição semelhantes. Assim, comparamos a responsividade CCL17 versus CCL22, dos linfócitos T de ILC2 e CD4⁺ , tanto de machos como de fêmeas, animais desafiados por óvulos.