طريقة BSelex لتحديد واستعادة الأجسام المضادة الفردية مستضد محددة من خلايا الدم الطرفية البشرية أحادية النووية يجمع بين تدفق الخلايا مع PCR خلية واحدة والاستنساخ.
يمثل مرجع الأجسام المضادة البشرية مصدراً غير مستغل إلى حد كبير للأجسام المضادة العلاجية المحتملة والمؤشرات الحيوية المفيدة. في حين أن الأساليب الحسابية الحالية، مثل تسلسل الجيل التالي (NGS)، تسفر عن مجموعات هائلة من البيانات عن ذخيرة الأجسام المضادة على مستوى التسلسل، فإن البيانات الوظيفية مطلوبة لتحديد التسلسلات ذات الصلة بمستضد معين أو مجموعة من مستضدات. هنا، نقوم بوصف طريقة لتحديد واستعادة الأجسام المضادة الخاصة بالمستضد من الخلايا أحادية النووية في الدم المحيطي (PBMCs) من متبرع بالدم البشري. تستخدم هذه الطريقة الإثراء الأولي للخلايا الناضجة B وتتطلب مزيجًا من علامات الخلايا الفينوتية والبروتين المسمى بفلورسنت لعزل خلايا ذاكرة IgG B عبر قياس التدفق الخلوي. ثم يتم استنساخ المناطق المتغيرة سلسلة الثقيلة والخفيفة وإعادة فرزها. على الرغم من أن تقتصر على حجرة الخلية B الذاكرة، هذا الأسلوب يستفيد من تدفق قياس الخلايا لاستجواب الملايين من الخلايا B وإرجاع المقترنة سلسلة الثقيلة والخفيفة تسلسل من خلية واحدة في شكل جاهز للتعبير وتأكيد الخصوصية. ويمكن النظر في الأجسام المضادة التي يتم استردادها بهذه الطريقة للإمكانات العلاجية، ولكن يمكن أيضا ربط الخصوصية والوظيفة مع نُهج المعلوماتية الحيوية لتقييم ذخيرة الخلية باء داخل الأفراد.
الأجسام المضادة هي فئة متنامية من الجزيئات العلاجية، وذخيرة الخلية B الموجودة في أي إنسان هو مصدر محتمل لهذه الأجسام المضادة. وعندما يتم استردادها من متبرع بشري، فإنها لا تحتاج إلى تكييف أو “إضفاء الطابع الإنساني”، وهي خطوات مطلوبة للأجسام المضادة المتولدة في نظم حيوانية أخرى. توجد عدة طرق لتحديد وعزل الأجسام المضادة البشرية، بمافي ذلك تنشيط الخلية B وانتشارها 1، الخلود عبر تحويل EBV2،3،وتوليد خطوط الخلايا الهجينة4 ،5. ومع ذلك، تتطلب كافة هذه الطرق ثقافة الخلية واسعة لفحص واستعادة الأجسام المضادة الخاصة بالمستضد. وقد تم توسيع نطاق المعلومات المتعلقة بذخيرة الأجسام المضادة البشرية إلى حد كبير مع تطوير الجيل التالي من تكنولوجيا التسلسل ، مما يسمح بتحديد كميات هائلة من التسلسلات الفردية الموجودة في عينات المانحين. ومع ذلك، ونظراً لأن الـ NGS تعطي رؤية لا أدرية لجميع التسلسلات الموجودة، فإنها لا تسمح بتحديد وعزل الأجسام المضادة الخاصة بالمستضد، لا سيما في حالة الأجسام المضادة النادرة أو المنخفضة التردد.
الغرض من طريقة “BSelex” هو تحديد الأجسام المضادة الخاصة بالمستضد من تعميم خلايا الدم الطرفية أحادية النووية في المتبرعين البشريين، وعزل واستعادة تسلسل هذه الأجسام المضادة لمزيد من التحليل. تستخدم هذه الطريقة قياس التدفق الخلوي وفرز الخلايا للاستفادة من مستقبلات الخلايا B (BCR) المعبر عنها على سطح خلايا الذاكرة B. يمكن فحص الملايين من الخلايا B للحصول على خصوصية المستضد عن طريق قياس التدفق الخلوي قبل بدء أساليب البيولوجيا الجزيئية ذات الإنتاجية المنخفضة. لا يمكن التعرف على سلسلة الثقيلة والخفيفة المقترنة في معظم أساليب NGS، التي تحلل تسلسل الخلايا بكميات كبيرة. في الطريقة التي نصفها هنا، يتم عزل الخلايا بشكل فردي، والانتعاش المقترن من كل من تسلسل سلسلة الثقيلة والخفيفة هو ممكن، والذي يسمح الاستنساخ المباشر والتعبير عن IgG الكامل.
الطريقة المعروضة هنا تجمع بين قياس التدفق الخلوي واستنساخ خلية واحدة، والأساليب التي نصفها هنا استنادا إلى الأساليب التي وضعتها سابقا تيلر والزملاء11. يصف عملهم الانتعاش واستنساخ الأجسام المضادة أحادية النسيلة من أجل دراسة ذخيرة الخلية B في البشر على مستوى الخلايا الفردية. لقد قمنا بتكييف المكونات الرئيسية لعمليتها للسماح باستعادة الأجسام المضادة أحادية النسيلة الخاصة بالمستضد من مجموعة من خلايا الذاكرة B، بما في ذلك استراتيجية التمهيدي التضخيم متعددة الخطوات. التعديل الرئيسي هو إضافة مستضد المسمى “الطعم”. وقد أُدخلت تعديلات إضافية على البروتوكول المنشور، بما في ذلك (على سبيل المثال لا الحصر) تعديل العمود الفقري لناقلات الاستنساخ إلى بلازميد واحد، وتغطية تمهيدية إضافية لذخيرة النضدة (تسلسل القائد والإطار 1 على حد سواء)، نقل خلايا HEK293 تعليق للتعبير العالي، واستخدام البوليمرات عالية الدقة أثناء تضخيم PCR.
بالنسبة للأساليب الموضحة هنا، فإن الخطوات الأكثر أهمية هي بالقرب من الانتقال بين قياس التدفق الخلوي واستنساخ خلية واحدة. أولا، وضع السليم من الخلايا المفردة فرزها في لوحة أمر ضروري. تعيين تأخير الإفلات بشكل صحيح على فارز خطوة رئيسية. ويجب أيضا أن تؤخذ في الاعتبار العوامل البيئية، مثل انخفاض الرطوبة، حيث وجدنا أن كفاءة الانتعاش لدينا تنخفض انخفاضا كبيرا ما لم يستخدم مدفع ثابت على لوحات الفرز المستهدفة. بعد وضع الخلية، يتم طرد الصفائح للتأكد من أن الخلايا قد اتصلت 10 ميكرولتر من العازلة في الجزء السفلي من الآبار. كل هذه التدابير حاسمة بالنسبة لجزء البيولوجيا الجزيئية لتكون ناجحة. إذا كانت الظروف دون الأمثل لرد فعل النسخ العكسي لخلية واحدة، يمكن أن يكون من الصعب تضخيم PCR حتى β-actin. قوة الطريقة المعروضة هي القدرة على استجواب الملايين من الخلايا وفرز فقط تلك التي تتطابق مع معايير التفاعل مستضد ضد مستضد الاختيار. وهذا يتطلب نسبة الإشارة إلى الضوضاء لتكون عالية قدر الإمكان، ويتم ذلك عن طريق تحسين تركيزات الطعم قبل الفرز. يتم استخدام الطعم المزدوج المسمى للحد من استعادة الخلايا الإيجابية الكاذبة، والتي يمكن أن تحدث إذا كان أحد الفلوروفورس لديه خلفية عالية. استخدام أكثر من طعم مستضد واحد يمكن أن تجعل الإشارة: تحسين الضوضاء أكثر صعوبة، ولكن القدرة على استجواب الببتيدات متعددة في وقت واحد هو فائدة أخرى من هذه الطريقة.
عندما تكون كفاءة الاسترداد منخفضة، يتم استخدام مجموعة من التمهيديات المتداخلة β-actin لتأكيد وجود قالب cDNA. العيب في هذا النهج هو أنه من الصعب تحديد ما إذا كان هناك أي خلية موجودة في البئر أو فشل رد فعل النسخ العكسي، مما يجعل استكشاف الأخطاء وإصلاحها صعبة. في بعض الأحيان سوف يحدث العكس والكفاءة أعلى مما كان متوقعا. الانتعاش نموذجي للسلسلة الثقيلة بين 30-45٪ وسلاسل الضوء هي أعلى، بين 40-60٪. كل تفاعل PCR (الخطوة الأولى والثانية) يستخدم 50 دورة لتضخيم من خلية واحدة. كما أن العدد الكبير من الدورات الإجمالية يجعل هذه الطريقة عرضة للتلوث. ويمكن استخدام تحليل تسلسل الامبوليكون اتّبع لتحديد ما إذا كان قد تم إدخال ملوث، أو إذا كان معدل استرداد مرتفع بشكل غير عادي قد تحقق بصورة مشروعة.
فائدة هذه الطريقة لاسترداد الأجسام المضادة البشرية الأصلية ضد مستضد من الاختيار لديها العديد من القيود الهامة. أولا، يمكن استخدام البروتينات القابلة للذوبان فقط التي يمكن وصفها بأنها “طعم” لتدفق قياس السيتومترية. بالنسبة للأنواع المعروضة في النتائج التمثيلية، استخدمنا سلسلة من الببتيدات المتداخلة المركبة من بروتين تاو، حيث أن استخدام البروتين بأكمله ثبت أنه صعب. استخدام الببتيدات الخطية من المرجح أن لا يكون الأمثل، لأنه قد يحد من تحديد الأجسام المضادة ضد الepitopes غير الخطية أو الهيكلية. ومع ذلك، تمكنا من تحديد العديد من الأجسام المضادة فريدة من نوعها ضد تاو وهذه تخضع حاليا لمزيد من التقييم8،9. وثمة قيد آخر هو انخفاض الإنتاجية لاسترداد البيولوجيا الجزيئية واستنساخ الـ IgGs. تسمح استراتيجية الفرز الأولية بفحص الملايين من الخلايا، ولكن معالجة البيولوجيا الجزيئية اللاحقة تتكون من مراحل متعددة. وقد أدت جهود التحسين الجارية لدمج التكنولوجيات الأحدث، مثل جمعية جيبسون10، إلى تبسيط عدة خطوات، ولكن لا يزال الاختناق هو استنساخ أزواج السلاسل الثقيلة والخفيفة الفردية.
تستخدم طريقة “BSelex” BCR المعرب عنها على سطح خلايا الذاكرة B لتحديد الخلايا التي تعرض تفاعلالمستضد، ثم استرداد هذه الخلايا الفردية عبر قياس التدفق 11و12. وبسبب هذا الاعتماد على BCR، يقتصر الأسلوب على حجرة الخلية B الذاكرة، ولا يلتقط خلايا إفراز الأجسام المضادة (ASCs) مثل البلازما. ومع ذلك، قد يكون هذا النهج مفيداً لاستعادة ذخيرة أوسع من الغلوبين المناعي الخاص بالمستضد اتّبع بالمقارنة بـ ASCs. وتبين دراسات التطعيم ضد الأنفلونزا أنه في حين يمكن أن يهيمن على هذه اللقاحات التفاعلية عدد صغيرمن الحيوانات المستنسخة من الخلايا باء الموسعة، فإن عدد الخلايا B الذاكرة الخاصة بالمستضد نادراً ما يكون 12. مستقبلات الخلايا T (TCR) على سطح الخلايا T تمتلك أوجه التشابه مع مستقبلات الخلية B في ترتيب الجينات وإعادة تركيب هادىن التنوع. وقد وضعت نهج خلية واحدة مماثلة لما هو موضح في الطريقة المعروضة هنا لتقييم ذخيرة الخلية T، بما في ذلك الاستعادة واستنساخ خلية واحدة من سلاسل ألفا وبيتا13. ومع ذلك، يتطلب التعرف على TCR الببتيدات التي تقدمها جزيئات MHC، مما يضيف تعقيدًا كبيرًا لنهج الطعم المسمى لتحديد الخلايا T الخاصة بالببتيد. على عكس الخلايا B، لا تخضع الخلايا T لنضج التقارب للمنطقة المتغيرة بأكملها، لذلك فإن تحديد منطقة CDR3 القصيرة وبعض التسلسل المحيط هو كل ما هو مطلوب لتحديد وإعادة تشكيل. وأخيرا، يصف هذا الأسلوب تحديد جزيئات IgG باستخدام قياس التدفق الخلوي، ولكن من الممكن أيضا استخدام علامات الفينوتيبيك البديلة لتحديد الخلايا B من أنواع متساوية مختلفة.
وفي الوقت الراهن، يجري تطوير أساليب لربط الكمية الهائلة من البيانات التي يتم جمعها من الجيل التالي من التسلسل بالتحليل الوظيفي لخصوصية المستضد، ولكن هذه الأساليب لا تزال قيد التحسين. على الرغم من قيوده، وقد استخدمت الطريقة الموصوفة هنا لتحديد الأجسامالمضادة ذات القيمة العلاجية المحتملة لكل من الأمراض المعدية وغير المعدية 8،14،15،ويمثل موثوق بها نهج لاستعادة IgGs مستضد محددة ذات الصلة من البشر، دون التلاعب واسعة النطاق من الخلايا B أو ثقافة الخلية واسعة النطاق.
The authors have nothing to disclose.
ويود المؤلفون أن يشكروا لوسي شماس، ومارثا كوستا، وجولي كيم، ونانسي هيريديا، وجيريمي ماسيدو على الاختبار المكثف للعديد من تعديلات الأسلوب وصقل منصة BSelex الحالية.
MoFlo Astrio EQ, Cell Sorter | MoFlo | cell sorting | |
Biotinylated peptides | New England Peptide | Cell sorting "bait" | |
Micro Bio-spin P30 gel column | BioRad | #7326223 | |
Streptavidin (R-PE) | Thermo Scientific | SA10041 | |
Streptavidin (APC) | Thermo Scientific | S32362 | |
CD22 MicroBeads, human | Miltenyi | #130-046-401 | |
LS columns | Miltenyi | #130-042-401 | |
Pre separation filters | Miltenyi | #130-041-407 | |
PerCp-Cy5.5 mouse anti-human CD19 | BD Biosciences | BD#340951 | |
PE-Cy7 mouse anti-human CD27 | BD Biosciences | #560609 | |
FITC mouse anti-human IgG | BD Biosciences | #560952 | |
DAPI | Life Technologies | #D21490 | |
RNaseOUT | Life Technologies | #10777-019 | |
Bovine serum albumin, Fraction V | Sigma | #A4503 | |
RPMI media | Hyclone | #SH30096.01 | |
HI FBS (Fetal bovine serum) | Invitrogen | #10082147 | |
Mastercycler Gradient | Eppendorf | Model #6325 | PCR machine |
PCR 96-well plates | Phenix | MPS-500 | |
PCR Plate mats | Phenix | SMX-PCR96 | |
Advantage UltraPure PCR Deoxynucleotide Mix | Clontech | #639125 | |
Superscript IV First-strand synthesis system | Invitrogen | #18091050 | |
Phusion High Fidelity Polymerase | Thermo Scientific | F-531-L | |
Platinum polymerase | Invitrogen | #10966108 | |
Nuclease-free water | QIAGEN | #129114 | |
Oligonucleotide primers | IDT | assorted | Primers for all PCR steps |
Gel Extraction Kit | QIAGEN | #28706 | |
PCR Purification kit | QIAGEN | #28106 | |
Miniprep Kit | QIAGEN | #27106 | |
NEBuilder HiFi DNA Assembly Cloning Kit | New England Biolabs | E5520S | Gibson assembly |
Expi293 Expression Media | Invitrogen | #A14351-01 | |
ExpiFectamine 293 Transfection Kit | Invitrogen | #A14525 | |
Opti-MEM Media | Invitrogen | #31985070 | |
CO2 incubator (Multitron) | |||
Octet RED384 System | Pall/ Forte Bio | ||
Pierce Streptavidin Coated High Binding Capacity Clear 96-well Plates | Thermo Scientific | #15500 | |
Corning Costar 96-well Polystyrene Plate High Binding Half Area | Corning | #3690 | |
Goat Anti-human IgG Fab Secondary Antibody | Jackson Labs | #109-036-097 | |
Goat Anti-mouse HRP Secondary Antibody | Jackson Labs | #115-035-072 | |
SureBlueTM TMB Microwell Peroxidase Substrate (1-Component) | KPL | #52-00-03 | |
TMB Stop Solution | KPL | #50-85-06 |